[发明专利]一种精子表面出云蛋白1的定量检测方法

摘要

本发明提供一种精子表面出云蛋白1的定量检测方法，通过精子分离预处理，精子前处理暴露精子Izumo1蛋白表位，使用荧光素标记精子Izumo1蛋白并使用流式细胞仪检测。本发明首次利用流式细胞术对人类精子中Izumo1蛋白进行定量检测，直接实现了对Izumo1蛋白的精确定量，且操作易于标准化，快速准确，精密度高。相对于传统的细胞免疫荧光，荧光原位杂交等定性或半定量检测Izumo1蛋白的方法，本发明方法具有检测方便，精密度高，速度快等优势，可在定量检测精子表面Izumo1蛋白表达中的应用，易于推广，检测结果可用于对精子受精能力进行辅助评估，适于实用。

主权项

一种精子表面出云蛋白1的定量检测方法，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)精子分离预处理a.将三份含有10％血清替代物的4‑羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲人输卵管液以体积比为3：1比例加入一份精液标本中并混匀，b.离心5分钟洗涤精子两次，c.吸除上清液，取1ml含有10％血清替代物的G‑IVF液小心加在洗涤后的精子沉淀物上方，d.将试管45°角斜放入培养箱内培养30分钟使精子上游，e.将上游后的精子离心5分钟，取沉淀后的精子放置于37摄氏度培养箱内备用；(2)分离后精子样本前处理，暴露出云蛋白1表位a.取精子前处理反应培养液加入到处理后的精子沉淀中，混匀，并调整精子终浓度为1‑5×10⁷/ml，放入6％二氧化碳，37摄氏度培养箱内反应2小时，使精子充分反应，暴露精子出云蛋白1表位；b.将充分反应后的精子加入1×磷酸缓冲盐溶液离心5分钟，洗涤两次后用磷酸缓冲盐溶液重悬备用；(3)使用流式细胞仪检测精子出云蛋白1表达情况a.每例样本分别设一管实验管和一管同型对照管，在实验管和对照管中分别加入500μl洗涤后精子，实验管中加入Izumo1多克隆一抗(1:200)，对照管加等量磷酸缓冲盐溶液，室温下孵育1小时，b.将孵育后的精子使用1×磷酸缓冲盐溶液洗涤两遍，c.在实验管中加入异硫氰酸荧光素标记的荧光二抗(1:400)，在对照管中加入FITC标记的同型对照抗体(1:400)，室温下避光孵育一小时，d.将孵育后的精子使用1×磷酸缓冲盐溶液洗涤两遍，洗去未结合的荧光标记抗体，e.在实验管和对照管中加入500μl含有1mg/ml乙二胺四乙酸的磷酸缓冲盐溶液重悬样本后上机检测，f.流式细胞仪检测采用设门法，检测指标为阳性百分率和平均荧光强度，g.采用ROC曲线划定截断值，计算界定受精能力的精子出云蛋白1阳性百分率。