[发明专利]一种准确计数无脊椎动物血淋巴中微生物的丰度的方法

摘要

本发明公开了一种准确计数无脊椎动物血淋巴中微生物的丰度的方法。步骤：用75%乙醇对取血部位进行消毒，用1 mL注射器抽取血淋巴，将血淋巴以1:1的体积比与ACD抗凝剂混合。用5μm孔径滤膜过滤去除血淋巴中的血细胞，将获得的滤液再过滤0.2μm孔径滤膜。用SYBR®Green I荧光染液染色0.2μm孔径滤膜，然后对其制片后在荧光显微镜上进行观测。统计每个视野中的微生物数量，最后根据公式计算血淋巴中微生物的丰度。本发明方法可准确计数拟穴青蟹、凡纳滨对虾和葡萄牙牡蛎等无脊椎动物血淋巴中包括可培养微生物和未培养微生物在内的所有微生物，其计数结果比平板菌落计数法高约2个数量级，其变异系数也明显低于平板菌落计数法。本发明方法具有计数准确度高、抗干扰能力强、出结果快、应用广泛等优点。

主权项

1.一种准确计数无脊椎动物血淋巴中微生物的丰度的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)配制ACD抗凝剂，调节pH至4.6，高压蒸汽灭菌后在低温中保存；(2)无脊椎动物消毒，重复多次；(3)在无脊椎动物合适部位抽取血淋巴，迅速与ACD抗凝剂混合；(4)用含有5μm孔径滤膜过滤，收集滤液；(5)用含有0.2μm孔径滤膜过滤，将滤膜转移至干净的培养皿中；(6)避光向滤膜滴加荧光染液染色，移除荧光染液后滴加甘油溶液；(7)荧光显微镜观察计数，根据如下公式计算血淋巴微生物的丰度：