[发明专利]一种小球藻锌结合类金属硫蛋白体外螯合镉的试验方法

摘要

本发明公开了一种本发明公开了小球藻锌结合类金属硫蛋白体外螯合镉的试验方法，首先培养获得小球藻锌结合类金属硫蛋白，蛋白纯度达95％以上。每个蛋白分子可结合7个锌原子，蛋白质分子由80个氨基酸组成，其中含半胱氨酸占氨基酸总数的15％。该蛋白具有哺乳动物金属硫蛋白的结构特征。分别用高效液相色谱－电感耦合等离子体质谱联用的方法及模拟消化液方法研究了小球藻锌结合类金属硫蛋白对Cd2+的螯合特性。结果表明，小球藻锌结合类金属硫蛋白对Cd2+具有一定的螯合能力，但在模拟胃液环境中螯合率仅为4.20％；而在模拟肠液环境中螯合率可达38.62％。

主权项

一种小球藻锌结合类金属硫蛋白体外螯合镉的试验方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)提取小球藻类金属硫蛋白：对普通海洋小球藻用100μg·mL‑1葡萄糖酸锌进行胁迫培养3天，离心收集藻细胞，经反复冻融三次并结合超声波细胞破碎，使藻细胞破碎率达到70％以上；利用Φ4.5×70cm的葡聚糖凝胶柱G‑75，以10mmol·L‑1Tris‑HCl为流动相，按3.0mL·min‑1的流速进行洗脱，以兔肝金属硫蛋白为对照，收集目标组分、冻干；用Φ4.5×70cm的葡聚糖凝胶G‑25层析柱进行脱盐，以3.0mL·min‑1的超纯水进行洗脱，收集目标蛋白组分并冻干，蛋白纯度95％以上；(2)用液质联用SEC‑ICP‑MS的方法证明小球藻类金属硫蛋白对Cd2+的螯合作用：将小球藻锌结合类金属硫蛋白分别配制成0.6、0.3、0.1mgmL‑1三个浓度，在每个浓度水平中加入500ng·L‑1的Cd2+，室温下通过垂直旋转混匀仪混匀反应30min，反应液经7.8mmi.d.×300mm，6μm的体积排阻色谱TSKgel‑G3000PWXL‑色谱柱分离，分离组分在线导入电感耦合等离子体质谱ICP‑MS，同时监测锌和镉的信号强度，通过比较锌和镉的信号位置和信号强度变化说明螯合作用；(3)在模拟胃液环境中小球藻类金属硫蛋白对镉的螯合实验：用模拟胃液配制含100ng·L‑1的Cd2+的溶液，分装于塑料离心管中，每管30mL；用模拟胃液配制含0‑20μg·mL‑1系列浓度的小球藻锌结合类金属硫蛋白溶液，往各透析袋中加入2mL此蛋白溶液，将透析袋分别置于含Cd2+的塑料离心管内；于37℃水浴震荡10h，通过测定透析袋外缓冲液中Cd2+浓度的变化，计算小球藻锌结合类金属硫蛋白对Cd2+的螯合率；另配制含10‑200ng·L‑1不同Cd2+浓度的模拟胃液，分装于塑料离心管中，每管30mL；用模拟胃液配制10μg·mL‑1的小球藻锌结合类金属硫蛋白溶液，并分别往各透析袋中加入2mL该蛋白溶液，然后将透析袋置于塑料离心管内；将塑料离心管置于水浴恒温震荡器中，于37℃水浴震荡10h，通过测定透析袋外缓冲液中Cd2+浓度的变化，计算小球藻锌结合类金属硫蛋白对Cd2+的螯合率；(4)在模拟肠液环境中小球藻类金属硫蛋白对镉的螯合实验：用模拟肠液配制含100ng·L‑1的Cd2+的溶液，分装于塑料离心管中，每管30mL；用模拟肠液配制含0‑20μg·mL‑1系列浓度的小球藻锌结合类金属硫蛋白溶液，往各透析袋中加入2mL此蛋白溶液，将透析袋分别置于含Cd2+的塑料离心管内，于37℃水浴震荡10h，通过测定透析袋外缓冲液中Cd2+浓度的变化，计算小球藻锌结合类金属硫蛋白对Cd2+的螯合率；另配制含10‑200ng·L‑1不同Cd2+浓度的模拟肠液，分装于塑料离心管中，每管30mL；用模拟肠液配制10μg·mL‑1的小球藻锌结合类金属硫蛋白溶液，并分别往各透析袋中加入2mL该蛋白溶液，然后将透析袋置于塑料离心管内，将塑料离心管置于水浴恒温震荡器中，于37℃水浴震荡10h，通过测定透析袋外缓冲液中Cd2+浓度的变化，计算小球藻锌结合类金属硫蛋白对Cd2+的螯合率。