[发明专利]一种提高人羊膜间充质干细胞成骨分化效率的方法及应用

摘要

本发明涉及一种提高人羊膜间充质干细胞成骨分化效率的方法，该方法为在人羊膜间充质干细胞中添加诱导组合物，该组合物包括0.1～2g/L透明质酸、0～200mg/L前列腺素E2受体选择性激动、1～100 nmol/L地塞米松、0～10mmol/L β‑甘油磷酸钠和1～100mg/L抗坏血酸。本发明与常规诱导方法相比，可显著提高人羊膜间充质干细胞成骨分化效率，促进碱性磷酸酶的表达及活性，增强RunX2、Osx、BSP、Ocn、ALP和Col1α1等成骨相关基因的表达，以及矿化钙结节的形成。本发明可在人间充质干细胞成骨分化中应用，以及在骨缺损、骨创伤等骨病中应用。

主权项

一种提高人羊膜间充质干细胞成骨分化效率的方法，其特征在于：所述提高人羊膜间充质干细胞成骨分化效率的具体步骤为：（1）人羊膜间充质干细胞的分离培养：将健康足月剖宫产新鲜胎盘钝性机械剥离羊膜，用含1%双抗的D‑Hank’s液反复冲洗羊膜，除去残留血渍和表面粘液后；将羊膜剪成1～3 cm2大小，分装于50 mL离心管内，加入约羊膜组织2倍体积的含0.02% EDTA‑2Na 的0.05% 胰蛋白酶消化液，于35～37 ℃恒温水浴箱中，150～185rpm旋转消化约30 min，经300目不锈钢滤网过滤后，弃去含有羊膜上皮细胞的消化液，重新加入新鲜的含0.02% EDTA‑2Na 的0.05% 胰蛋白酶消化液，重复消化一次，再次经300目不锈钢滤网过滤后，弃去消化液；经上述胰蛋白酶消化后剩余的羊膜组织用含1% 双抗的D‑Hank’s液清洗一次，除去残留的胰蛋白酶消化液，加入含0.05 mg/mL DNase I的 0.5 mg/mL II型胶原酶消化液，于35～37 ℃恒温水浴箱中，150～185rpm旋转消化1～2 h，直至剩余的羊膜组织碎片完全消化成絮状，经300目不锈钢网过滤，收集细胞滤液，1500 rpm，4℃离心10min，弃上清，细胞沉淀即为人羊膜间充质干细胞；用含10%胎牛血清的低糖DMEM重悬细胞，种于T25细胞培养瓶，在35～37℃，含1～10% CO2及85～100%空气饱和湿度恒温培养，待细胞融合度达80%以上进行传代培养；（2）人羊膜间充质干细胞向成骨分化诱导组合物的制备：在1L高糖DMEM完全培养基中，加入0.1～2 g/L透明质酸、0～200mg/L 前列腺素E2受体选择性激动、1～100 nmol/L地塞米松、0～10mmol/L β‑甘油磷酸钠和1～100mg/L抗坏血酸的诱导剂，即得提高人羊膜间充质干细胞成骨分化效率的诱导组合物；（3）诱导组合物促人羊膜间充质干细胞成骨分化的方法：取2代对数生长期人羊膜间充质干细胞，按2×105 cells/孔的细胞量，接种于6孔板内，0～48小时后加入诱导组合物，每2～3天换一次应用基质和诱导组合物，在35～37℃，含1～10% CO2及85～100%空气饱和湿度恒温培养箱内培养14～21天，诱导分化终止。