[发明专利]一种高通量提取园艺植物叶片基因组DNA的方法

摘要

本发明涉及植物分子生物学领域，具体提供一种高通量提取园艺植物叶片基因组DNA的方法。该方法简单快捷，无需液氮研磨，制备通量高，耗费时间短，DNA得率和纯度比较高；并且，本发明在裂解液中用高浓度的氯化锂替代了氯化钠，使得到的DNA基本不含RNA污染。本发明得到的DNA可用于园艺植物群体遗传学、系统进化、分子标记、和常规PCR等实验，适用于普通生物实验室研究，具有巨大的应用前景。 1

主权项

1.一种高通量提取园艺植物叶片基因组DNA的方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)取10‑30mg植物叶片置于1.5ml离心管中，再加入200‑300ul研磨液，10‑15mg石英砂和维生素C的混合物，用电动研磨仪研磨至匀浆状，补加1ml所述研磨液，涡旋混匀；

(2)在8000rpm，室温离心1分钟，去除离心所得上清液，向沉淀中加入500‑700ul 65℃预热的裂解液和10ul 2‑巯基乙醇，涡旋混匀，60‑65℃保温10‑15分钟；

(3)待步骤(2)中的混合液冷却至室温后，加入与步骤(2)中的裂解液等体积的氯仿，剧烈震荡30s，室温下，放置2分钟；再于13000rpm，室温下，离心5‑10分钟；

(4)取300‑400ul上清，转入另一离心管中，加入1/4所述上清体积的5M氯化钠，颠倒混匀，再加入2倍混合液体积的无水乙醇，颠倒混匀，室温放置10‑15分钟；再于13000rpm，室温下，离心5‑10分钟，弃上清，得沉淀；

(5)向步骤(4)中得到的沉淀加入400ulTE，用移液器吹打，溶解，再加入1/10所述TE体积的3M醋酸钠，pH5.2，颠倒混匀，再加入2倍混合液体积的无水乙醇，颠倒混匀，室温放置10‑15分钟；再于13000rpm，室温下，离心5‑10分钟，弃上清，得沉淀。

(6)将步骤(5)所得沉淀用70‑75％乙醇洗涤后，室温下风干6‑10分钟，加入50ul TE溶液，得到基因组DNA；

所述研磨液的配方组成为：

200mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸、50mM乙二胺四乙酸二钠、0.2M的氯化钠和0.2g/L交联聚乙烯吡咯烷酮，pH8.0；

所述裂解液的配方组成为：体积比为1:1的A液和B液；

所述A液的配方为：0.4g/L的十六烷基三甲基溴化铵、200mM的三羟甲基氨基甲烷·盐酸、50mM的乙二胺四乙酸二钠和0.4g/L的聚乙烯吡咯烷酮，平均分子量10000，pH8.0；

所述B液的配方为：8M氯化锂；

所述TE配方为：

10mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸和1mM乙二胺四乙酸二钠。

2.根据权利要求1所述的高通量提取园艺植物叶片基因组DNA的方法，所述步骤(1)、(2)和(3)替代为：

(1)取10‑30mg植物叶片置于1.5ml离心管中，再加入200‑300ul裂解液，10‑15mg石英砂和维生素C的混合物，用电动研磨仪研磨至匀浆状，补加300‑400ul裂解液和10ul 2‑巯基乙醇，涡旋混匀，60‑65℃保温10‑15分钟；

(2)待步骤(1)中的混合液冷却至室温后，加入与步骤(2)中的第一次和第二次加入的裂解液体积之和等体积的氯仿，剧烈震荡30s，室温下，放置2分钟；再于13000rpm，室温下，离心5‑10分钟。

3.根据权利要求1所述的高通量提取园艺植物叶片基因组DNA的方法，所述步骤(5)、(6)替代为：

(5)将步骤(4)所得沉淀用70‑75％乙醇洗涤后，室温下风干6‑10分钟，加入50ul TE溶液，得到基因组DNA。

4.根据权利要求1所述的高通量提取园艺植物叶片基因组DNA的方法，其特征是，步骤(1)中，所述石英砂和维生素C的质量比为1：1.

5.根据权利要求1所述的高通量提取园艺植物叶片基因组DNA的方法，其特征是，所述电动研磨仪由小型电钻和设置于所述电钻上的金属研磨棒组成。

6.根据权利要求1所述的高通量提取园艺植物叶片基因组DNA的方法，其特征是，所述植物叶片为植物新鲜叶片或室温干燥保存的叶片；所述植物为草莓、桃、梨、柑橘、李子、甘蓝或南瓜。