[发明专利]一种高通量提取园艺植物叶片基因组DNA的方法

说明书

本发明涉及植物分子生物学领域，具体提供一种高通量提取园艺植物叶片基因组DNA的方法。该方法简单快捷，无需液氮研磨，制备通量高，耗费时间短，DNA得率和纯度比较高；并且，本发明在裂解液中用高浓度的氯化锂替代了氯化钠，使得到的DNA基本不含RNA污染。本发明得到的DNA可用于园艺植物群体遗传学、系统进化、分子标记、和常规PCR等实验，适用于普通生物实验室研究，具有巨大的应用前景。

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种高通量提取园艺植物叶片基因组DNA的方法。

背景技术

足量的高品质DNA是展开植物分子生物学研究的基础，但是，目前，园艺植物细胞中常含有大量的色素、多糖、酚类等次生代谢产物，特别是多糖在DNA提取过程中的共沉淀，使提取的DNA呈胶状难以溶解，纯度显著下降。

常规使用的CTAB法、SDS法、尿素提取法和高盐低pH法在提取园艺植物DNA时或耗时长、操作复杂，或提取效果差，易降解，或提取成本非常昂贵，具体为：

常规的CTAB法需要用液氮研磨材料，提取过程中需要使用酚/氯仿抽提2-3轮，且需要低温长时间离心，耗时长，操作繁琐，提取通量低，每人每天只能提取5-10份，耗时长，并且效率非常低下。

使用常规CTAB法及其它方法提取的基因组DNA中一般都有大量的RNA污染，需要加入RNA酶消化去除RNA。

现有技术中通常所采用的高通量制备DNA的方法，或需要使用组织研磨仪在96孔板或普通EP管中进行高通量研磨，设备昂贵（5-10万元/台），常规实验室无法使用，或直接将材料在稀碱溶液中煮沸裂解，效果不稳定易降解。

并且，目前市场上的商业试剂盒在提取植物DNA时一般都需要液氮研磨材料，其质量和效果因生产批次不同而不稳定，且价格比较昂贵，难以进行高通量提取。

一些改进的CTAB法、SDS法、酶解法虽能进行高通量制备，但提取的DNA纯度不高，且一般需要组织研磨仪等特殊设备，难以满足常规实验室的要求。

发明内容

针对于现有技术中存在的上述问题，本发明的目的是提供一种经济、快速、去糖效果良好、高通量的园艺植物叶片基因组DNA提取方法，该方法采用改良的提取液和制备工艺，能够从少量植物叶片提取高质量的DNA，具有巨大的应用价值。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

提供一种高通量提取园艺植物叶片基因组DNA的方法，包括以下步骤：

（1）取10-30mg植物叶片置于1.5ml离心管中，再加入200-300ul研磨液，10-15mg石英砂和维生素C的混合物，用电动研磨仪研磨至匀浆状，补加1ml所述研磨液，涡旋混匀；

（2）在8000rpm，室温离心1分钟，去除离心所得上清液，向沉淀中加入500-700ul65℃预热的裂解液和10ul 2-巯基乙醇，涡旋混匀，60-65℃保温10-15分钟；

（3）待步骤（2）中的混合液冷却至室温后，加入与步骤（2）中的裂解液等体积的氯仿，剧烈震荡30s，室温下，放置2分钟；再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟；

（4）取300-400ul上清，转入另一离心管中，加入1/4所述上清体积的5M氯化钠，颠倒混匀，再加入2倍混合液体积的无水乙醇，颠倒混匀，室温放置10-15分钟；再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟，弃上清，得沉淀；

（5）向步骤（4）中得到的沉淀加入400ulTE，用移液器吹打，溶解，再加入1/10所述TE体积的3M醋酸钠，pH5.2，颠倒混匀，再加入2倍混合液体积的无水乙醇，颠倒混匀，室温放置10-15分钟；再于13000rpm，室温下，离心5-10分钟，弃上清，得沉淀。