[发明专利]一种ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体及其筛选方法与应用

摘要

本发明提供一种ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体及其筛选方法与应用，该筛选方法包括以下步骤：1)第一链cDNA的合成；2)PCR扩增；3)构建AGPase大小亚基cDNA原核表达载体；4)活性筛选。本发明将来源于不同物种的AGPase大亚基基因与小亚基基因进行远缘杂交，高可控性地获重组基因的表达载体；再转化大肠杆菌glgC突变菌株，再接种于Conberg加富固体培养基上，最后用碘-碘化钾染色筛选出高活性ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体，该筛选方法简单易行、稳定可靠；该ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体酶活性、糖原含量明显高于野生型玉米AGPase，且对底物亲和力没有明显改变，但对激活剂敏感性增加。

主权项

一种ADP‑葡萄糖焦磷酸化酶突变体的筛选方法，由以下步骤制得：1)第一链cDNA的合成：提取玉米种子总RNA和甘薯总RNA，以总RNA为模版，反转录合成玉米胚乳第一链cDNA和甘薯第一链cDNA；2)PCR扩增：以步骤1)合成的第一链cDNA为模版，分别在扩增引物对的引导下，PCR扩增得到玉米的AGPase大亚基cDNA、甘薯的AGPase大亚基cDNA、玉米的AGPase小亚基cDNA和甘薯的AGPase小亚基cDNA；3)构建AGPase大小亚基cDNA原核表达载体：构建含有步骤2)得到的玉米的AGPase大亚基cDNA和甘薯的AGPase小亚基cDNA的AGPase大小亚基cDNA原核表达载体；或构建含有甘薯的AGPase大亚基cDNA和玉米的AGPase小亚基cDNA的AGPase大小亚基cDNA原核表达载体；构建野生型玉米胚乳AGPase大小亚基cDNA的原核表达载体，作为对照品；4)活性筛选：将步骤3)得到的AGPase大小亚基cDNA原核表达载体以及对照品分别转化大肠杆菌glgC突变菌株，筛选阳性克隆，挑取阳性单克隆接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养12‑24小时，然后于Conberg加富培养基上进行划线，37℃培养12‑24小时；用碘‑碘化钾(I₂‑KI)溶液进行染色菌落，筛选颜色较对照品更深的阳性菌落，得到高活性ADP‑葡萄糖焦磷酸化酶突变体；所述Conberg加富固体培养基包括以下组分：磷酸二氢钾8‑9g，磷酸氢二钾10‑12g，酵母提取物5‑7g，葡萄糖8‑12g，琼脂15‑25g，用水定容至1L，最终pH7.0；碘‑碘化钾溶液为含0.08‑0.12mol/L碘和0.25‑0.35mol/L碘化钾的水溶液。