[发明专利]棒曲霉素的制备方法

摘要

一种棒曲霉素的制备方法，包括发酵、分离、纯化步骤。所制备的棒曲霉素，经高效液相色谱仪、核磁共振对产物进行分析鉴定，核磁共振的表征数据以及质谱仪确定产物的分子量，确认所制备的产物为棒曲霉素。各项指标达到sigma公司同类产品的指标，产品的成本是sigma公司同类产品的1/380，大大降低了产品的成本。

主权项

一种棒曲霉素的制备方法，其特征在于包括下述步骤：(1)发酵每个250mL三角瓶中装入100g去皮苹果块作为培养基，加8层纱布塞，121℃灭菌20分钟；将扩展青霉FP2菌株接种PDA试管斜面，28℃活化7天，每支试管斜面加入无菌水制备成浓度为10⁷cfu/mL孢子悬液，每个装100g苹果培养基的三角瓶中接入1mL浓度为10⁷cfu/mL的孢子悬液，28℃避光恒温培养10天，获得培养物；(2)分离取培养物，分别研磨成糊状，每100g加入乙酸乙酯100mL，150～200r/min避光振荡抽提1小时，静置5～10分钟分层，收集上层乙酸乙酯抽提液，下层培养物中加入乙酸乙酯100mL/100g，150～200r/min避光振荡抽提2小时，静置5～10分钟分层，收集乙酸乙酯抽提液，下层培养物中再加入乙酸乙酯100mL/100g，150～200r/min避光振荡抽提1小时，静置5～10分钟分层，合并三次乙酸乙酯抽提液，用无水硫酸钠过滤后，40℃旋转蒸发至干燥，用pH为4.0的冰醋酸水溶液定溶至50mL，用0.22μm水系滤膜过滤，得到棒曲霉素的粗提取液；取棒曲霉素的粗提取液500μL，稀释100倍，按照中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2008‑‑2007《进出口果汁中棒曲霉毒素的检测方法高效液相色谱法》检测其中棒曲霉素含量；使用的色谱柱为：柱，250mm×4.6mm(内径)，粒径5μm；棒曲霉素标准品，购于Sigma公司，准确吸取2mL pH为4.0的冰醋酸水溶液，充分溶解10mg棒曲霉素标准品，吸取其中1mL的棒曲霉素溶液，稀释为30mg/L、60mg/L、90mg/L、120mg/L、150mg/L的标准液，以棒曲霉素的出峰面积X为横坐标，棒曲霉素含量Y为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程：Y＝0.4789X+0.2114(R²为0.9994)根据绘出的标准曲线和测定出的棒曲霉素峰面积计算棒曲霉素的含量；(3)纯化‑70℃，100Pa冷冻干燥棒曲霉素的粗提取液至干燥，用100mL乙酸乙酯充分溶解，40℃旋转蒸发乙酸乙酯至10～15mL，200～300目硅胶柱层析纯化，用丙酮与二氯甲烷或三氯甲烷体积比为1∶20～40的洗脱剂洗脱，湿法装柱，干法上样，用薄层层析法检测每管洗脱液中含有棒曲霉素的情况；将含有棒曲霉素的洗脱液合并，40℃避光旋转蒸发至干，溶于10～15mL的石油醚与乙酸乙酯体积比为1∶0.5～3的溶剂中；再次200～300目硅胶柱层析，用石油醚与乙酸乙酯体积比为1∶0.5～3的洗脱剂洗脱，湿法装柱，干法上样，用薄层层析法检测每管洗脱液中含棒曲霉素的情况；将只含有棒曲霉素的溶液合并，避光40℃旋转蒸干，溶于5～15mL的乙酸乙酯中，静止放置，得到棒曲霉素产物；上述薄层层析法的条件为：采用硅胶GF₂₅₄层析板，乙酸乙酯与石油醚体积比1∶2为展开剂，展层3次，在254nm的紫外灯下，对比观察样品与从Sigma公司购买棒曲霉素标准品的R_f值。