[发明专利]一种人原代角质细胞分离制备的方法

摘要

本发明公开了一种人原代角质细胞分离制备的方法，其包括以下步骤：(1)原代角质细胞分离；(2)原代角质细胞培养；(3)原代角质细胞冻存；(4)原代角质细胞活性检测。本发明提供的角质细胞分离制备的方法，采用DKSFM成分限定的无血清角质细胞专用培养体系，不含牛血清成分及滋养层细胞，避免了非人源活性蛋白及其它生物成分的引入，使下游研究体系更单一；直接冻存原代细胞，复苏后细胞具有更高的存活率，同时由于采用成分限定的无血清角质细胞专用培养基，减少了促进细胞分化的因子含量，有利于角质细胞体外培养周期的延长，表现出更多的倍增次数，使下游研究体系更稳定。

主权项

一种人原代角质细胞分离制备的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)原代角质细胞分离：取新鲜皮肤样本经乙醇消毒，去除皮肤表面微生物的污染，之后用磷酸盐缓冲液清洗若干次，去除样本上的残余乙醇，将样本切割成直径为2mm的微小颗粒；用35～45mL酶活为150‑300U/mL的胶原蛋白酶处理所得微小颗粒，4℃过夜放置；过滤收集含角质细胞的表皮组织，并放入胰酶‑EDTA中35～40℃处理1‑3小时，分离角质细胞；在转速为1800rpm下离心收集细胞沉淀；用40mL DMEM细胞培养基洗涤细胞2次；收集到的皮肤细胞用角质细胞专用培养液DKSFM重悬，使用血细胞计数仪对细胞数量及活性进行计算；调整为5×10⁴cells/cm²后接种在直径为100mm细胞培养皿上；(2)原代角质细胞培养：接种后第2天，倒置显微镜下观察细胞贴壁生长状态，记录生长状态；细胞接种后每天更换新鲜DKSFM培养基；细胞接种后每天观察记录细胞贴壁生长情况；(3)原代角质细胞冻存：细胞接种培养3‑7天后达到60‑90％的汇合度，弃去培养基，用磷酸盐缓冲液清洗数遍；用5mL TrypLE处理细胞，在37℃，5‑10分钟；显微镜下观察细胞收缩情况，待所有细胞变圆后加入10mL DKSFM，轻微吹打使细胞分散成悬液，取出100ul细胞进行细胞计数，在1800rpm下离心收集细胞沉淀；90％DKSFM+10％DMSO配置细胞冻存液，根据细胞计数结果，按照1×10⁶cells/mL添加细胞冻存液，重悬细胞，置入程序性降温盒，放入零下80℃超低温冰箱过夜冻存细胞；从上步冻存盒中取出细胞，放入液氮罐中长期保存，并记录保存批次及数量；(4)原代角质细胞活性检测：从同一批冻存的原代角质细胞中任意选取1管，37摄氏度水浴中迅速融化细胞，加入不含抗生素的DKSFM细胞培养液，取出100ul进行细胞数量和存活率的计算；细胞悬液1800rpm离心，收集细胞沉淀；DKSFM重悬细胞，使细胞均匀分散，接种细胞培养皿；之后在37℃下采用5％的CO₂培养；隔天更换培养基，至细胞汇合度达到40‑60％时，改为每天更换培养基；每天用倒置显微镜观察细胞生长状态及有否细菌感染情况，并拍照记录；细胞汇合度达到60‑90％时，传代细胞；细胞持续培养至完全分化，停止增殖时，根据最终细胞数量及复苏时起始细胞数量，计算倍增周期及次数。