[发明专利]一种转基因大豆食用油荧光定量PCR检测的方法

摘要

本发明属于生物检测技术领域，具体为一种转基因大豆食用油荧光定量PCR检测的方法。针对食用油脂中核酸含量低、破坏严重、DNA序列片段短的特点，本发明利用DNA提取试剂盒法加核酸富集处理步骤，有效地从大豆食用油中提取到可用于PCR扩增反应的DNA模板，设计并筛选了能有效扩增DNA模板的引物，通过实时荧光定量PCR技术定性检测出了大豆的内源基因以及外源调控序列，为食用油原料是否转基因的检验提供了一种稳定有效的方法。本发明的方法也适用经过高温处理（烹饪）以后的食用油。

主权项

一种转基因大豆食用油荧光定量PCR检测的方法，其特征在于具体步骤为：（1）用CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒提取大豆食用油中的DNA；（2）设计并筛选得到扩增tRNA基因的一对引物，扩增18S基因的一对引物，扩增Lectin基因的一对引物，分别为：tRNA： SEQ.ID.NO1SEQ.ID.NO218S：  SEQ.ID.NO3SEQ.ID.NO4Lec：  SEQ.ID.NO5 SEQ.ID.NO6（3）设计大豆外源基因35S启动子引物、NOS终止子引物，分别为：35S： SEQ.ID.NO7   SEQ.ID.NO8NOS：SEQ.ID.NO9SEQ.ID.NO10（4）提取非转基因东北大豆的基因组DNA，进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入tRNA、18S、Lec引物进行扩增；（5）扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制tRNA、18S、Lectin基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR标准曲线；（6）对含有带35S启动子和NOS终止子序列质粒的细菌进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入35S启动子和NOS终止子引物进行扩增，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，并绘制35S启动子和NOS终止子引物的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR标准曲线；（7）向DNA提取液中分别加入tRNA、18S、Lec、35S和NOS引物，进行扩增，每个引物重复3次；扩增后，测定DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的各基因的定量PCR标准曲线，估计提取液中DNA的含量，从而判断是否从食用油中提取出了可供PCR检测的DNA，各内源基因的损失情况以及样品是否为转基因食用油。