[发明专利]一种提取和检测鱼类精子膜蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种提取和检测鱼类精子膜蛋白的方法，包括样品的预处理、精子悬液的制作、精子的悬浮处理、精子膜蛋白分离、精子膜蛋白去脂纯化、精子膜蛋白的SDS-PAGE检测以及精子膜蛋白质谱检测的步骤；本方法在传统去污法的基础上，拟合了蛋白酶抑制剂和TM-PEK法的特点，所提取的鱼类精子膜蛋白盖度达到86%以上，平均每5×107个精子中可得到0.6mg膜蛋白和0.8mg胞质蛋白。本发明专利方法的推广应用可以为鱼类精卵作用机制以及受精机理的探明提供基础资料；可以为鱼类的增养殖尤其是江海洄游性鱼类的生殖繁育提供指导；可以为其他水生生物物种的精子膜蛋白研究提供有用的参考方法。

主权项

一种提取和检测鱼类精子膜蛋白的方法，其特征在于，按照以下步骤进行：（1）对所采集的鱼类精巢或成熟精子样本使用PBS与质量浓度为0.7% NaCl的漂洗缓冲液进行漂洗，除去碎屑物质，得到样品液； （2）缓冲漂洗后，采用悬浮缓冲液对样品进行悬浮处理0.5‑1h；加悬浮缓冲液再进行悬浮处理1‑2 h；取悬浮上清液加精子膜蛋白分离液，混匀，置摇床上，冰浴缓慢振摇 1.5 h，然后 4 ℃ 离心，上清为精子膜蛋白溶液，沉淀为脱膜精子； （3）将得到的精子膜蛋白溶液转移至试管中，在25℃下孵育15‑20 分钟，对混合物进行离心，获得悬液的相分层，上层为水相层，下层为膜蛋白混合物层；留下层液体用于后续的膜蛋白纯化；使用冰浴的TBS稀释所得膜蛋白粗提物，重复精子膜蛋白的分离步骤，得到较好浓度和纯度的精子膜蛋白，取少量溶液测其蛋白含量，其余‑20℃保存备用；（4）对所抽提的精子膜蛋白进行SDS‑PAGE 电泳，使用5×SDS‑PAGE样品溶解液对样品进行处理； （5）对所抽提的精子膜蛋白进行纳米级串联质谱Nano‑LC MS/MS技术检测。