[发明专利]一种提取和检测鱼类精子膜蛋白的方法

权利要求书

1.一种提取和检测鱼类精子膜蛋白的方法，其特征在于，按照以下步骤进行：

（1）对所采集的鱼类精巢或成熟精子样本使用PBS与质量浓度为0.7% NaCl的漂洗缓冲液进行漂洗，除去碎屑物质，得到样品液； 

（2）缓冲漂洗后，采用悬浮缓冲液对样品进行悬浮处理0.5-1h；加悬浮缓冲液再进行悬浮处理1-2 h；取悬浮上清液加精子膜蛋白分离液，混匀，置摇床上，冰浴缓慢振摇 1.5 h，然后 4 ℃ 离心，上清为精子膜蛋白溶液，沉淀为脱膜精子； 

（3）将得到的精子膜蛋白溶液转移至试管中，在25℃下孵育15-20 分钟，对混合物进行离心，获得悬液的相分层，上层为水相层，下层为膜蛋白混合物层；留下层液体用于后续的膜蛋白纯化；使用冰浴的TBS稀释所得膜蛋白粗提物，重复精子膜蛋白的分离步骤，得到较好浓度和纯度的精子膜蛋白，取少量溶液测其蛋白含量，其余-20℃保存备用；

（4）对所抽提的精子膜蛋白进行SDS-PAGE 电泳，使用5×SDS-PAGE样品溶解液对样品进行处理； 

（5）对所抽提的精子膜蛋白进行纳米级串联质谱Nano-LC MS/MS技术检测。

2.根据权利要求1所述的提取和检测鱼类精子膜蛋白的方法，其特征在于，步骤（1）中使用PBS的浓度为0.01M。

3.根据权利要求1所述的提取和检测鱼类精子膜蛋白的方法，其特征在于，步骤（2）中4 ℃离心条件为12000 r/min，10min。

4.根据权利要求1所述的提取和检测鱼类精子膜蛋白的方法，其特征在于，步骤（3）中离心条件为5000g，20-25分钟。

5.根据权利要求1所述的提取和检测鱼类精子膜蛋白的方法，其特征在于，步骤（3）中重复精子膜蛋白的分离步骤为2-4次。