[发明专利]一种提取和检测鱼类精子膜蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于动物精子检测领域，特别涉及一种提取和检测鱼类精子膜蛋白的方法。

背景技术

动物的精子是一类结构和功能都十分特化的细胞，精子膜表面存在多种膜蛋白和蛋白受体复合物等，它们与精子发生、成熟获能、精卵识别、受精过程等生殖生物学活动有重要功能。

精子膜表面蛋白是精子发生、成熟和精卵相互作用的重要分子，对其深入研究有助于揭示精子发生、成熟获能和受精的生物学机制。成熟精子的质膜表面含有多种蛋白，它们自身固有或是外界粘附到精子表面，在维持精子形态结构完整等过程中发挥着重要的作用，特别是与精卵识别结合以及质膜融合等过程密切相关。因此精子膜蛋白组分的测定对于探索鱼类精子获能，精卵识别和生殖过程的生物学机制是非常重要的。

精子膜蛋白抽提方法通常是使用去污剂、超声破碎、蔗糖密度梯度离心、生物素化等方法进行。抽提得到的精子膜蛋白往往需要透析浓缩(李彦臻等，2008)，精子悬液悬浮处理(潘洪强,2001)和利用链亲和素对膜蛋白进行分离富集和洗脱等(Shetty et al.,2001)等步骤。这些步骤的会导致所提取精子膜蛋白的量和纯度。目前，对人类和其他一些哺乳动物的精子膜蛋白研究报道较多，一些水生生物如海胆(Echinoidea)和鲍(Haliotis)是目前研究较多的实验材料。但有关鱼类精子膜蛋白的研究均未见报道。

发明内容

本发明的目的在于为了克服以上现有技术的不足而提供一种提取和检测鱼类精子膜蛋白的方法。

本发明是由以下技术手段实现的：

一种提取和检测鱼类精子膜蛋白的方法，按照以下步骤进行：

（1）对所采集的鱼类精巢或成熟精子样本使用PBS与质量浓度为0.7%NaCl的漂洗缓冲液进行漂洗，除去碎屑物质，得到样品液；

（2）缓冲漂洗后，采用悬浮缓冲液对样品进行悬浮处理0.5-1h；加悬浮缓冲液再进行悬浮处理1-2h；取悬浮上清液加精子膜蛋白分离液，混匀，置摇床上，冰浴缓慢振摇1.5h，然后4℃离心，上清为精子膜蛋白溶液，沉淀为脱膜精子；

（3）将得到的精子膜蛋白溶液转移至试管中，在25℃下孵育15-20分钟，对混合物进行离心，获得悬液的相分层，上层为水相层，下层为膜蛋白混合物层；留下层液体用于后续的膜蛋白纯化；使用冰浴的TBS将所得膜蛋白粗提物，重复精子膜蛋白的分离步骤，得到较好浓度和纯度的精子膜蛋白，取少量溶液测其蛋白含量，其余-20℃保存备用；

（4）对所抽提的精子膜蛋白进行SDS-PAGE电泳，使用5×SDS-PAGE样品溶解液对样品进行处理；

（5）对所抽提的精子膜蛋白进行纳米级串联质谱Nano-LC MS/MS技术检测。

所述的提取和检测鱼类精子膜蛋白的方法，步骤（1）中使用PBS的浓度可以为0.01M。

所述的提取和检测鱼类精子膜蛋白的方法，步骤（2）中4℃离心条件可以为12000r/min，10min。

所述的提取和检测鱼类精子膜蛋白的方法，步骤（3）中离心条件可以为5000g，20-25分钟。

所述的提取和检测鱼类精子膜蛋白的方法，步骤（3）中重复精子膜蛋白的分离步骤可以为2-4次

基于对长江刀鲚等江海洄游性鱼类的精子膜蛋白提取和检测的反复验证，本发明提供的方法可以高效快速提取鱼类精子膜蛋白，可以平均从5×10⁷个精子中可得到0.6mg膜蛋白，0.8mg胞质蛋白，整个提取过程可在2小时内完成。该方法与传统的精子膜蛋白的提取方法相比，具有耗时少，效率高，在其他动物物种的精子膜蛋白研究中都可以推广应用。通过该方法所提取的精子膜蛋白纯度和盖度高，可以用于精子发生和受精生物学的机制研究，研究结果可以为鱼类的增养殖尤其是江海洄游性鱼类的生殖繁育提供指导。

本专利方法采用去垢剂法和精子悬液处理的方法提取鱼类精子膜蛋白，具有耗时短，所提精子膜蛋白产量和纯度高的优点。

附图说明

图1是提取长江刀鲚精子膜蛋白的SDS-PAGE检测和WB鉴定图。

具体实施方式

实施例1

本实施例以长江刀鲚鱼作为试验对象，进行其精子蛋白的提取和检测。

本实施例中所用的试剂以及配制方法如下：

(1)A液：0.25M蔗糖，0.1M Tris-HCl，0.5M苯甲酰胺，1mM EDTA，等体积混合得到A液；

B液：质量比为5%果糖，0.01M枸橼酸钠，等体积混合得到B液；