[发明专利]大豆胚尖生长点转化方法

摘要

本发明涉及一种大豆胚尖生长点转化方法。包括如下步骤：获得大豆带一片子叶并暴露生长点的外植体，利用农杆菌真空渗透辅助侵染，转化得到转基因大豆。大豆的外植体为无菌环境下，无菌水培养萌发后去掉种皮，一片子叶和全部原叶，暴露生长点的胚尖；所述方法为用蘸取农杆菌的针尖对胚尖进行划刺，之后放入农杆菌液中，真空渗透辅助侵染，0.05MPa压力5-8分钟，吸取表面菌液，干燥后于无菌水中黑暗条件下共培养3天后，于光照条件下共培养7天，转入温室中直至接种，T1代检测。本发明未经组织培养阶段，不需要严格无菌，可在较短时间内获得大量再生植株，用于大豆基因工程的基本操作系统，对于大豆品质改良具有重要的理论和实践意义。

主权项

大豆改良胚尖真空渗透辅助的外源基因转化方法，步骤包括：（1）大豆外植体的获得；（2）农杆菌菌液制备；（3）真空渗透辅助侵染与共培养；（4）转化外植体再生；（5）移栽、筛选；（6）大豆外植体的获得；其特征在于：步骤（1）中，口杯氯气灭菌法：用氯酸钠：浓盐酸=10：1，在乐扣杯中制造氯气，灭菌4‑6h；超净工作台中通风使氯气散尽后加适量无菌水，25‑28℃黑暗环境中浸泡萌发12‑15 h ；步骤（1）中，取吸胀萌动的大豆种子，在无菌滤纸上吸取多余水分，剥去种皮，沿远种脐端将两片子叶分开，去掉一片子叶和原叶，保留完整胚和另一片子叶，获得带一片子叶的胚尖外植体，将外植体胚尖向上竖直插入预培养基中预培养24 h；步骤（1）中，在超净工作台中，用无菌移液器从含卡那霉素50 mg/L 利福平霉素25 mg/L的 LB培养平板上吸取含有目的质粒的农杆菌单菌落接种于含抗生素的LB 液体培养基， 28℃， 200 r/min振荡培养14‑16小时，然后以1：10‑20进行2次活化，培养至 OD600 = 1. 0，将菌液置于灭菌的离心管中，4000r/min 25℃离心10min收集菌体，将菌体重悬于液体共培养基，调整OD600 = 0. 5 作为工程菌液备用；步骤（3）中，将预培养 24 h 已转绿的外植体从培养基中取出，加入预先制备好的工程菌液，抽真空并维持0.05MPa压力5‑8分钟，28℃黑暗环境下150 r/min振荡侵染1 h ，弃去菌液，将外植体近轴面朝下置于固体共培养培养基中， 26‑28℃黑暗环境下共培养3 d。