[发明专利]一种结核分枝杆菌RNA/DNA同步定量分析方法

摘要

本发明属于生物工程检测技术领域，具体为一种结核分枝杆菌RNA/DNA同步定量分析方法。本发明包括如下步骤：结核分枝杆菌特异性定量PCR和RT‑qPCR引物和探针设计；标准DNA的克隆和质粒改造；细菌RNA与DNA的同时抽提；在同一反应管中同时进行RT‑qPCR和PCR；荧光定量PCR检测方法的建立和优化。利用本发明的方法可以实现对结核分支杆菌的快速定量检测，并确定细菌的生长活性状态。本发明方法简单、灵敏度高、特异性强，解决了现有检测方法中检测周期长、阳性率低、不能区分细菌的生长状态的问题，对基础研究、临床快速诊断，及药物开发和药物使用效果的临床评价具有重要的实际意义。

主权项

一种非诊断目的的结核分枝杆菌RNA/DNA同步定量分析方法，其特征在于具体步骤如下：（1）通过生物信息学分析，选择结核分支杆菌的16S rRNA的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：SEQ ID NO.5；选择结核分支杆菌的23S rDNA基因的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：SEQ ID NO.9；（2）应用primer express软件和primer premier 5.0软件，设计关于16S rRNA和23S rDNA的引物和探针序列，具体为：16S rRNA引物和探针序列：逆转录引物：SEQ ID NO.1；上游引物： SEQ ID NO.2；下游引物： SEQ ID NO.3；Taqman探针序列： SEQ ID NO.4；23S rDNA引物和探针序列：上游引物： SEQ ID NO.6；下游引物： SEQ ID NO.7；Taqman探针序列： SEQ ID NO.8；（3）构建和制备质粒定量标准品利用DNA重组技术将包含目的扩增片段的基因SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.9克隆到质粒载体pGEM‑T Easy Vector中，构建的重组质粒作为检测结核杆菌RNA/DNA同步定量分析的定量标准品；（4）分离样本中结核分枝杆菌，提取总核酸，使提取的样本中同时含有DNA与RNA成分；（5）分别以结核分枝杆菌复合群的16S rRNA和23S rDNA为靶目标，对16S rRNA，使用设计的一条逆转录引物SEQ ID NO.1、一对PCR引物SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3以及一条Taqman探针SEQ ID NO.4；对23S rDNA，使用设计的另一对PCR引物SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7以及另一条Taqman探针SEQ ID NO.8，对提取的同一例样本同时进行RT‑qPCR，其中，RT部分为单重的只针对16S rRNA的逆转录反应, qPCR部分为两重的针对16S rRNA和23S rDNA的实时定量PCR反应；通过比较16S rRNA 和23S rDNA的Ct值以及5个绝对浓度已知的定量内参做出的标准曲线，求得待测标本中结核分枝杆菌DNA的绝对浓度，作为待测标本中结核分枝杆菌DNA定量检测结果；计算分别对应FAM和HEX检测通道的16S rRNA与23S rDNA的Ct值，算出(DNA+RNA)/DNA比值，作为判定标本中结核分枝杆菌生长活性的标准：当该比值大于200时，待测标本中结核分枝杆菌为活跃生长的活菌，当比值在2‑200之间，为生长较慢的活菌，比值小于2时，为不生长的死菌。