[发明专利]一种抗犬细小病毒蛋白VP2特异性IgY的制备方法无效
| 申请号： | 201310459834.4 | 申请日： | 2013-09-30 |
| 公开（公告）号： | CN103570830A | 公开（公告）日： | 2014-02-12 |
| 发明（设计）人： | 张小莺;何金鑫;田泽华 | 申请（专利权）人： | 西北农林科技大学 |
| 主分类号： | C07K16/08 | 分类号： | C07K16/08;C07K16/02;C07K14/015;C12N15/35;C12N15/70 |
| 代理公司： | 北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) 11350 | 代理人： | 汤东凤 |
| 地址： | 712100 *** | 国省代码： | 陕西;61 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种抗犬细小病毒蛋白VP2特异性IgY的制备方法，包括以下步骤：（1）根据CPV-VP2基因序列，设计一对引物，PCR扩增CPV-VP2基因，连接至pMD18-T载体，转化DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后，提取质粒，酶切分析，阳性质粒测序，对测序结果进行比较分析；（2）VP2蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化:pMD18-T-VP2和pET-32a载体使用BamH I和Xho I双酶切，目的片段连接，构建pET-32a-VP2表达载体，转化Bal21（DE3）pLysS感受态细菌，酶切和PCR鉴定后，优化IPTG诱导浓度和时间，进行大量诱导表达，使用Ni+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化；（3）抗VP2-IgY抗体的制备：纯化的VP2蛋白免疫产蛋鸡，使用PEG6000提取特异性IgY抗体，并进行SDS-PAGE分析。本发明提取的抗VP2-IgY抗体可较好地结合VP2蛋白，而与降解片段无交叉反应。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 细小 病毒 蛋白 vp2 特异性 igy 制备 方法 | ||
【主权项】：
一种抗犬细小病毒蛋白VP2特异性IgY的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：（1）犬细小病毒VP2基因的克隆与序列分析；（2）VP2蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化；（3）抗VP2‑IgY抗体的制备，具体的包括以下步骤：（1）犬细小病毒VP2基因的克隆与序列分析：根据CPV‑VP2基因序列，利用软件设计一对引物，PCR扩增CPV‑VP2基因，连接至pMD18‑T载体，转化DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后，提取质粒，酶切分析，阳性质粒测序，对测序结果进行比较分析；（2）VP2蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化：pMD18‑T‑VP2和pET‑32a载体使用BamH I和Xho I双酶切，目的片段连接，构建pET‑32a‑VP2表达载体，转化Bal21（DE3）pLysS感受态细菌，酶切和PCR鉴定后，优化IPTG诱导浓度和时间，进行大量诱导表达，使用Ni+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化；（3）抗VP2‑IgY抗体的制备：纯化的VP2蛋白免疫产蛋鸡，使用PEG6000提取特异性IgY抗体，并进行SDS‑PAGE分析。
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