[发明专利]用于叶籽银杏MSAP分析的DNA提取方法

摘要

本发明公开了一种用于叶籽银杏MSAP分析的DNA提取的方法。本发明通过嫁接复壮的叶籽银杏嫩叶为材料，采用改良CTAB法进行全基因组DNA的提取，通过提高β-巯基乙醇和PVP的浓度，去除杂质并防止褐化，加入氯仿异戊醇，二次抽提，有效去除蛋白质的含量。获得了高质量和高浓度的叶籽银杏基因组DNA，用MSAP技术进行分析，显示出了DNA甲基化的多态性。此方法不仅成本低，而且可以获得高浓度的基因组DNA，为叶籽银杏表观遗传学研究奠定了基础。

主权项

一种用于叶籽银杏MSAP分析的DNA提取方法，其特征在于该方法包括下述步骤：（1）研钵、研锤、药匙、2ml及1.5ml离心管等高压灭菌，液氮准备，2%CTAB、TE等试剂的配制，CTAB在65℃水浴锅中预热10min以上；（2）称新鲜嫩叶.015g‑0.20g，迅速倒入预冷的研钵中，倒入液氮迅速研磨，多次研磨至粉末状，立即转入装有700μL预热CTAB的2mL离心管中，加入35μLβ‑巯基乙醇和20％PVP140μL，充分混匀；（3）65℃温浴30min以上，中间颠倒离心管摇动3‑5次，取出后冷却至室温；（4）加入等体积的氯仿异戊醇24：1V/V，轻轻颠倒混匀，室温12000rpm离心10min；（5）吸取上清转入2mL的离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，然后加入20μL3mol.L‑1NaAc，一般离心管内会有棉团状DNA出现，‑20℃冰箱中放置30min以上；（6）3000rpm离心6min，弃上清，用70％乙醇洗涤2次，放置30min左右自然风干；（7）加600μL TE充分溶解DNA；（8）加入等体积的酚：氯仿：异戊醇25：24：1V/V，颠倒混匀，12000rpm离心10min；（9）吸取上清，加入等体积的氯仿：异戊醇，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心10min；（10）吸取上清转入2mL的离心管中，然后加入30μL3mol/L NaAc，一般离心管内会有棉团状DNA出现，‑20℃冰箱中放置30min以上；（11）3000rpm离心6min，弃上清，用70％乙醇洗涤2次，再用无水乙醇洗涤1次，自然风干；（12）加60μL TE充分溶解DNA；（13）待溶解后，加入4μL5mg/mL RNA酶，37℃水浴30min，冷却至室温，分装后4℃保存备用，‑20℃长期保存。