[发明专利]一种豌豆蛋白酶解制备抗氧化肽的方法及应用

摘要

一种豌豆分离蛋白酶解制备抗氧化肽的方法及应用，属于食品添加剂技术领域。本发明涉及以豌豆分离蛋白为原料，抗氧化性以DPPH自由基清除率为指标，优选出胰蛋白酶和中性蛋白酶组合分步酶解方案，得到豌豆蛋白水解产物PPH即抗氧化多肽粗品。该粗品PPH经SephadexG-25凝胶层析和两次RESOURCETM3RPC反相层析纯化获得高纯度的高抗氧化活性肽，浓度在0.2mg/mL时对DPPH自由基清除率达62.03%，与同浓度下谷胱甘肽对DPPH的清除率相近。反相高效液相(RP-HPLC)分析型色谱测定其纯度，超高效液相色谱-质谱法(Q-TOF-MS)分析鉴定其氨基酸序列。经脱盐后的PPH以不同添加量加到润肤霜中，经测定具有良好的稳定性和抗氧化能力。

主权项

一种豌豆分离蛋白酶解制备抗氧化肽的方法，其特征在于以豌豆分离蛋白为原料，抗氧化性以1,1‑二苯基‑2‑三硝基苯肼DPPH自由基清除率为指标，优选出胰蛋白酶和中性蛋白酶组合分步酶解方案，得到豌豆蛋白水解产物PPH，即抗氧化肽粗品；该粗品PPH经Sephadex G‑25凝胶层析和两次RESOURCETM 3RPC反相层析纯化获得高纯度的高抗氧化活性肽，步骤为：A豌豆分离蛋白酶解制备抗氧化肽（1）原料预处理：以豌豆分离蛋白为原料，配置质量浓度为7.5%的豌豆分离蛋白水溶液，90℃水浴15 min进行预处理，冷却备用；（2）胰蛋白酶酶解：随后放在恒温磁力搅拌器上，溶液边搅拌边调至温度40℃、pH 10，按照酶底比E/S为6%加入胰蛋白酶，胰蛋白酶酶活为4×104 U/g，开始水解反应，随时滴加2 M NaOH溶液保持酶解液pH 10不变，充分酶解反应4 h后，煮沸15 min灭酶；（3）中性蛋白酶酶解：步骤（2）产物冷却后按50℃、pH 7.5，E/S为6%加入中性蛋白酶，中性蛋白酶酶活为1×105 U/g，水解4 h，煮沸灭酶，冷却后用2 M HCl溶液调pH 7；（4）离心：步骤（3）产物按照8000 r/min离心15 min去沉淀，所得上清液为豌豆蛋白水解产物PPH，即抗氧化肽粗品；B 酶解豌豆抗氧化活性肽的分离纯化及鉴定方法（5）对PPH冻干样选用Sephadex G‑25进行分离，规格为1.6 cm×60 cm，配置浓度50 mg/mL，加样量为2 mL，以纯水为洗脱剂，流速为1.5 mL/min，在280 nm处检测吸光度，在相同浓度下检测各峰DPPH自由基的清除能力；收集抗氧化活性较高的峰组分，冷冻干燥；（6）选出抗氧化性高的一组分在AKTA蛋白质分析纯化仪上进行反相色谱纯化，样品溶解于含有0.05% (v/v) 三氟乙酸TFA的水溶液中，选用RESOURCETM 3RPC色谱柱，进样量为1 mL，以2 mL/min的流速用含5%乙腈和0.05%TFA的水溶液A进行洗脱，检测波长为215 nm，使用自动收集器收集洗脱峰；5 min后，以流速为3 mL/min进行梯度洗脱，20 min时达到100%溶液B，溶液B 为含60%乙腈和0.05%TFA的水溶液，每管5 mL进行收集；富集的样品进行旋转蒸发、冷冻干燥后测各组分的DPPH清除能力；（7） 选出DPPH清除率高的组分再一次进行反相层析，溶液C为：含10%乙腈和0.05%TFA的水溶液；溶液D为：含50%乙腈和0.05%TFA的水溶液；其他条件保持不变；按峰收集样品，旋转蒸发、冷冻干燥成粉末，检测各峰的DPPH清除能力，选出活性最高的峰进行冷冻干燥；当浓度在0.2 mg /mL时，对DPPH的清除率达到62.03%，接近于同浓度下生物体内存在的抗氧化肽GSH对DPPH的清除能力66.42%，有很强的抗氧化性；（8）利用RP‑HPLC分析型色谱测定纯化后的豌豆抗氧化肽样品，在9.436 min时出现一个比较纯的洗脱峰，纯度达到90.12%；经液质联用分析推测出相对分子量为956.5 Da，氨基酸序列为Phe‑Glu‑Gly‑Met‑Thr‑Phe‑Leu‑Leu。