[发明专利]在大肠杆菌构建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途径的基因及其构建方法

摘要

本发明公开了在大肠杆菌构建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途径的基因及其构建方法，通过分析5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途径的限速步骤、中间体供给及产物分泌等问题，克隆Rhodobactersphaeroides来源的ALA合成酶基因（hemA）、Propionibacteriumshermanil来源的辅酶A转移酶基因（Cat）以及Escherichiacoli来源的ALA分泌基因（YBi），借助pETDuet-1共表达载体，共表达了合成5-氨基乙酰丙酸的hemA、生成5-氨基乙酰丙酸合成的中间体琥珀酸COA的Cat和促进5-氨基乙酰丙酸的分泌的Ybi，三个基因的共表达加强了5-氨基乙酰丙酸的生物合成，通过本发明所制备的具有C4生物途径的基因，提高了Escherichiacoli的5-氨基乙酰丙酸产量，分泌到细胞外的ALA达到1124mg/L。

主权项

一种在大肠杆菌构建5‑氨基乙酰丙酸C4生物合成途径的基因，其特征在于借助pETDuet‑1载体，共表达三个基因：ALA合成酶基因hemA、辅酶A转移酶基因cat和ALA分泌基因YBi，所述基因序列如下：ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag    gagatatacc atgggcagca gccatcacca tcatcaccac agccaggatc cgaattcatg    gactacaatc tggcactcga taccgctctg aaccggctcc ataccgaggg ccggtaccgg    accttcatcg acatcgagcg gcgcaagggt gccttcccga aagccatgtg gcgcaagccc    gacgggagcg agaaggaaat caccgtctgg tgcggcaacg actatctcgg catgggccag    catccggtgg tgctgggggc catgcacgag gcgctggatt cgaccggcgc cgggtcgggc    ggcacgcgca acatctcggg caccacgctc tatcacaagc gcctcgaggc cgagctcgcc    gacctgcacg gcaaggaagc ggcgctggtc ttctcgtcgg cctatatcgc caacgacgcg    accctctcga cgctgccgca gctgatcccg ggcctcgtca tcgtctcgga caagttgaac    cacgcttcga tgatcgaggg catccgccgc tcgggcaccg agaagcacat cttcaagcac    aatgacctcg acgacctgcg ccggatcctg acctcgatcg gcaaggaccg tccgatcctc    gtggccttcg aatccgtcta ttcgatggat ggcgacttcg gccgcatcga ggagatctgc    gacatcgccg acgagttcgg cgcgctgaaa tacatcgacg aggtccatgc cgtcggcatg    tacggccccc gcggcggcgg cgtggccgag cgggacgggc tgatggaccg gatcgacatc    atcaacggga cgctgggcaa ggcctatggc gtgttcggcg gctatatcgc ggcctcgtca    aagatgtgcg acgcggtgcg ctcctacgcg ccgggcttca tcttctcgac ctcgctgccg    cccgtcgtgg cggccggtgc ggcggcctcg gtgcgccacc tcaagggcga tgtggagctg    cgcgagaagc accagaccca ggcccgcatc ctgaagatgc gcctcaaggg gctcggcctg    ccgatcatcg accacggctc gcacatcgtg ccggtccatg cgggcgaccc cgtgcactgc    aagatgatct cggacatgct gctcgagcat ttcggcatct atgtccagcc gatcaacttc    ccgaccgtgc cgcgcgggac cgagcggctg cgcttcaccc cgtcgcccgt gcatgattcc    ggcatgatcg atcacctcgt gaaggccatg gacgtgctct ggcagcactg tgcgctgaat    cgcgccgagg tcgttgcctg agcggccgcg ccgcataatc gaaattaata cgactcacta    taggggaatt gtgagcggat aacaattccc catcttagta tattagttaa gtataagaag    gagatataat gcctggttca ttacgtaaaa tgccggtctg gttaccaata gtcatattgc    tcgttgccat ggcgtctatt cagggtggag cctcgttagc taagtcactt tttcctctgg    tgggcgcacc gggtgtcact gcgctgcgtc tggcattagg aacgctgatc ctcatcgcgt    tctttaagcc atggcgactg cgctttgcca aagagcaacg gttaccgctg ttgttttacg    gcgtttcgct gggtgggatg aattatcttt tttatctttc tattcagaca gtaccgctgg    gtattgcggt ggcgctggag ttcaccggac cactggcggt ggcgctgttc tcttctcgtc    gcccggtaga ttccgtctgg gttgtgctgg cggttcttgg tctgtggttc ctgctaccgc    tggggcaaga cgtttcccat gtcgatttaa ccggctgtgc gctggcactg ggggccgggg    cttgttgggc tatttacatt ttaagtgggc aacgcgcagg agcggaacat ggccctgcga    cggtggcaat tggttcgttg attgcagcgt taattttcgt gccaattgga gcgcttcagg    ctggtgaagc actctggcac tggtcggtta ttccattggg tctggctgtc gctattctct    cgaccgctct gccttattcg ctggaaatga ttgccctcac ccgtttgcca acacggacat    ttggtacgct gatgagcatg gaaccggcgc tggctgccgt ttccgggatg attttcctcg    gagaaacact gacacccata cagctactgg cgctcggcgc tatcatcgcc gcttcaatgg    ggtctacgct gacagtacgc aaagagagca aaataaaaga attagacatt aattaagcgg    ccgcataatg cttaagtcga acagaaagta atcgtattgt acacggccgc ataatcgaaa    ttaatacgac tcactatagg ggaattgtga gcggataaca attccccatc ttagtatatt    agttaagtat aagaaggaga tatacatatg atgaacgaac gcatctccaa cgagaagttg    cgcggaaaga tcatgaccgc cgatgaggcc gcagccctta tccccaatgg agcccagatc    ggcttcggcg gtttcaccgg ctcgggttac ccgaaggaac tgccccaggc cctggccaac    aggatcaagg cagcccacga gcgcggcgag gaattcaccg tcaacgcgtt caccggtgcg    tccaccgctc ccgagctcga tggtgccctg gccggcgtcg atggcatgca ctaccgcatg    ccgtaccagt cggatccgac gctgcgcaag aagatcaacg acggcaccac gctgtacacc    gacatccacc tgtcgcactc ggcccagctg gtggccgagg gcttcatggg caagctcgac    ttcgccgtgg tcgaggccgt gcgcatcacc gaggacggga acatcgttcc cacctcgtcg    gtgggcaaca acaagaccta cctcgacatg gccgagaaga tcatcatcga ggtgaactcc    tggcagtcgc ccgacctcga gggaatgcac gatatctgga atggatatct gactcccccg    aaccgtccga tcatcccgat caacaatgtg ggcgaccgca tcggcgacac cttcctgacc    atcgattccg acaaggtcgt ggcggtcatc gagaccaccg accgtgaccg caactcgccg    ttcaagccga ttgacgacga ttcgcgcgcc attgccggct acctgctcga cttctatgcc    aacgaggtca agcacggccg cctgccgaag aacctgctgc cgctgcagtc cggcgtgggc    aatatcccca acgccgtgct cgacggcctg ctgcattccg acctcgagaa cctcaccagc    tacaccgagg tgatccagga cggcatggtc gacctgatcg acgccggcaa gctggccgtc    gcctcggcaa cggccttctc gctgagcccc gattacgcgc acaacatgaa tgagaacgcg    aagaactacc gcaagtcgat cgttcttcgt ccccaggaga tctcgaacca tcctgaggtc    atccgtcgcc tgggcgtgct gtcgtgcaat ggcatgatcg aggccgacat ctacggcaat    gtgaactcca cccacgtgat gggcacccgc atgatgaacg gcatcggtgg ttccggtgac    ttcacgcgca acgcctacat ctcggcattc gtgtcgccgt cgaccgccaa ggacggcgcc    atctcggcga tcgtgccgat ggtgagccac gtcgaccaca ccgagcatga cgtgatggtg    atcatcaccg agcagggcat cgccgacctc cgtggcctgg caccgcgcct gcgcgcccag    aagatcatcg acaattgcgt gcatcccgat ttccgtgcgc agctgcagga gtacttcgac    cactcgctgg tgacgtcgaa ggccaagcac acgccgcacg acctgcgcca ttcctacgat    tggcacctga acttcatcga gaacggcacg atgaagcttt cgcactaccg ttgacatatg   gcagatctca attggatatc ggccggccac gcgatcgctg acgtcggtac cctcgagtct    ggtaaagaaa ccgctgctgc gaaatttgaa cgccagcaca tggactcgtc tactagcgca    gcttaattaa cctaggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc    tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg attggcgaat    g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