[发明专利]在大肠杆菌构建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途径的基因及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物发酵领域，具体涉及一种在大肠杆菌构建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途径的基因及其构建方法。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸（ALA）是一种含氧元素和氮元素的碳氢化合物，是生物体合成四氢吡咯的前体，还是卟啉、（亚铁）血红素、叶绿素以及维生素B₁₂的结构类似物。ALA是一种生理活性非常活跃的非蛋白类氨基酸，其应用范围非常广阔。在农业上，作为一种光活化绿色无公害的除草剂、杀虫剂、抗微生物药剂和植物生长促进剂而得到广泛应用。在医学上，ALA被应用到癌症的光动力学治疗和诊断上；还具有促进血红素生成的作用。另外，5-氨基乙酰丙酸作为外用药可用于痤疮的治疗和作为生发剂使用。

ALA 在生物体内存在着两条合成途经（如图1所示），一种途径称为碳四途径（C4 pathway），存在于动物、真菌和α家族细菌中，由5-氨基乙酰丙酸合酶（ALA synthase，ALAS）催化琥珀酰COA和甘氨酸缩合成ALA。另一条途径被称为碳五途径（C5 pathway），存在于植物、藻类以及大部分细菌中，ALA来源于谷氨酸的碳骨架，由3个酶催化。由碳四途径和碳五途径获得的ALA均被共同的下游代谢酶ALA脱水酶催化形成胆色素原，然后进一步向下游转化。

大肠杆菌本身通过C5 途径合成ALA，但是，由于大肠杆菌不需要合成叶绿素，仅需要以ALA 为前体合成少量的维生素B12等四吡咯类化合物，因此其天然的ALA合成能力很弱。

目前，ALA的合成方法分为化学法和生物法两种。化学合成法合成步骤复杂，原料来途径窄，合成造价较高，致使目前ALA产品市场价格昂贵(约326美元/克)，制约了它的推广应用。生物合成ALA因工艺简单、产率高，具有工业化生产前景。近年来，国内外研究者利用基因工程菌生产ALA已经取得了一些进展。Kiatpapan和Murooka将类球红细菌(R.sphaeroides)的ALA合成酶的hemA基因在费氏丙酸菌中实现表达，ALA积累量达到1.1 g/L。Mariet和Zeikus通过过表达获得Escherichia coli重组菌，ALA发酵产量达到了3.79 g/L。Xie L.等利用含有hemA基因的重组大肠杆菌，经过发酵优化，ALA产量达到5.2 g/L。浙江大学Lin J.等通过优化hemA基因的表达和发酵条件，ALA产量达到7.3 g/L。但是上述有关ALA的合成方法中，只是针对hemA基因进行分子操作，所构建的基因工程菌都仅限于过表达ALA合成酶一个基因，没有强化C4生物合成途径中的中间物的合成和强化ALA的分泌途径。

发明内容

本发明要解决的技术问题，是提供一种在大肠杆菌构建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途径的基因及其构建方法，对ALA合成酶基因（hemA）、辅酶A转移酶基因（cat）以及ALA分泌基因（YBi）进行基因操作，借助pETDuet-1共表达载体，构建了一株具有较高表达水平的基因，通过共表达hemA、Cat和YBi使细胞外ALA的产量达到1124 mg/L。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

一种在大肠杆菌构建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途径的基因，借助pETDuet-1载体，共表达三个基因：ALA合成酶基因hemA、辅酶A转移酶基因cat和ALA分泌基因YBi，所述工程菌序列如下：

ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag    

gagatatacc atgggcagca gccatcacca tcatcaccac agccaggatc cgaattcatg    

gactacaatc tggcactcga taccgctctg aaccggctcc ataccgaggg ccggtaccgg    

accttcatcg acatcgagcg gcgcaagggt gccttcccga aagccatgtg gcgcaagccc    

gacgggagcg agaaggaaat caccgtctgg tgcggcaacg actatctcgg catgggccag