[发明专利]一种分子标记辅助选育豇豆耐旱品种的方法

摘要

本发明公开了一种分子标记辅助选育豇豆耐旱品种的方法，属于蔬菜生物技术育种技术领域。方法包括：（1）豇豆耐旱关联SNP分子标记位点1_1286的筛选；（2）SNP向CAPS标记的转化、扩增与酶切；（3）待检豇豆材料的准备；（4）待检豇豆材料苗期耐旱性的分子标记检测；和（5）待检成株茎杆持绿性Stg与农艺性状的表型复检等步骤。该方法具简单易行、快速灵敏、结果准确、成本低廉等特点，分子标记检测过程只需4～5小时，而成本仅为传统表型鉴定的二十分之一左右。本发明可在蔬菜育种、种子鉴定部门推广应用。

主权项

一种分子标记辅助选育豇豆耐旱品种的方法，其特征在于按以下步骤进行：    （1）豇豆耐旱关联SNP分子标记位点1_1286的筛选：用Qiagen公司的植物DNA小量提取试剂盒依说明书所述方法提取耐旱性程度各异的99份豇豆品系的DNA；利用豇豆 Kaspar SNP 基因型检测平台通过芯片杂交检测每份DNA上各1127个SNP位点的基因型，并按缺失信号率<20%，低丰度等位型即MAF值 < 0.1的标准去除低质量的SNP位点，最终保留422个SNP位点的基因型数据并被用于标记‑性状关联分析；将上述422个SNP位点的基因型数据与同上所述99份豇豆品系历年温室耐旱性鉴定获得的茎杆绿色程度值Stg，按Tassel软件的MLM的混合线性模型进行关联分析，从中获得与Stg显著关联的P<0.001的SNP标记1_1286；上述温室耐旱性鉴定方法为：对发芽后正常生长20‑24天开始甩蔓的植株终止浇水造成人工干旱胁迫，停水14天后对各份种质材料以其Stg即茎杆持绿色性为指标，按以下分级标准进行记载、统计：0级：茎杆正常，无失绿；1级：£20%茎杆失绿；2级：20%‑40%茎杆失绿；3级：40%‑60%茎杆失绿；4级：60%‑80%茎杆失绿；5级：>80%茎杆失绿至完全枯黄；     （2）SNP向CAPS标记的转化、扩增与酶切：根据SNP标记1_1286所在DNA片段序列，利用Macvector软件设计跨SNP位点的PCR引物1_1286CAPS；利用该对引物分别对耐旱豇豆亲本“饭豆”和不耐旱豇豆亲本‘ZJ106’的DNA按如下方法进行PCR扩增：反应体积25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl2 1.5微升, 2.5mM dNTPs 2微升, 活性为5单位/微升的Taq酶 0.2微升，模板DNA 10纳克，加水至25微升；SSR反应体系为DNA 94℃预变性 3min后，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸展1min,循环35次，最后72℃延伸10min；再将上述扩增产物按下述方法进行BfaI 酶切：酶切体系含PCR产物7微升，10×buffer 1微升，5单位/微升的BfaI 酶 0.2微升，加水至10微升，将酶切和非酶切PCR产物同时在1.5%琼脂糖胶上进行电泳分离，EB显色；其中“饭豆”的扩增产物能释放出180bp和353bp两条酶切片段，‘ZJ106’的扩增产物仅有533bp一条酶切片段；所述引物的正向序列为：GGATAGTACACTCTGGAATAGG，反向序列为：CTGACTTGAACTACTTGAGGAA；（3）待检豇豆材料的准备：以农艺性状好，耐旱性较弱的豇豆品种作为非耐旱轮回亲本，以耐旱性强，但农艺性状较差的豇豆品种作为耐旱供体亲本进行杂交，次年起回交2代或2代以上所得的种子作为待检材料，备用；（4）待检豇豆材料苗期耐旱性的分子标记检测：用标记1_1286CAPS 对步骤（3）的待检豇豆材料群体，按步骤（2）同样的工艺条件进行PCR扩增，在扩增产物中凡经BfaI酶切后能够释放出180bp和353bp两条酶切片段的材料，即为含豇豆耐旱基因分子标记的检测阳性材料予以保留；凡释放533bp一条酶切片段的材料，即为检测阴性材料予以淘汰；      （5）待检成株茎杆持绿性Stg与农艺性状的表型复检；将步骤（4）检测含有耐旱性基因的分离后代材料，培育至成株期后按步骤（1）温室耐旱性指标茎杆持绿性Stg的鉴定方法进行复检，从中将Stg分级<3的列为较耐旱的材料予以保留,而将Stg分级>3列入不耐旱的材料予以淘汰。