[发明专利]一种筛选人肿瘤相关的自然反义转录子的方法

摘要

本发明提供了一种筛选人肿瘤相关的自然反义转录子的方法，该方法包括提取癌细胞/正常细胞总RNA；DNase I及RNase I酶切；逆转录成cDNA及双链合成，加接头；抑制性消减杂交，PCR产物克隆建库，测序分析；对候选分子进行进一步实验验证等步骤。经在正常细胞和肿瘤细胞中应用验证，证实该方法可系统、快速的筛选人肿瘤相关的自然反义转录子。

主权项

一种筛选人肿瘤相关的自然反义转录子的方法，其特征在于，包含以下步骤：1）提取人正常细胞和对应的肿瘤细胞总RNA；2）分别加入过量的DNase I和RNase I，酶切步骤1）获得的人正常细胞及对应的肿瘤细胞总RNA，然后通过酚/氯仿抽提回收；3）以步骤2）中的双链RNA为模板，以随机六引物及逆转录酶将其反转录为cDNA；4）以随机六引物为引物，用T4DNA聚合酶催化合成cDNA第二链并补平末端；5）以Rsa I酶切双链cDNA，得到带有平末端的酶切产物，回收纯化后加双蒸水；6）将步骤5）的检测子cDNA分为两份，一份连接SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，一份连接SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；驱动子(Driver)cDNA不连接头；7）用T4DNA聚合酶补平粘末端，采用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀纯化后，加适量双蒸水溶解；8）以正常细胞和癌细胞互为检测子和驱动子进行双向抑制性消减杂交；其中在正向消减中，以癌细胞为检测子，以正常细胞为驱动子；在反向消减中,以正常细胞为检测子，以癌细胞为驱动子；9）将步骤8）的杂交产物用缓冲液稀释后作为模板进行两轮PCR扩增；PCR的引物核苷酸序列对应于SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；10）将步骤9）PCR扩增后的正向和反向消减杂交产物纯化，后与pGEM‑T载体连接克隆，并分别构建正向和反向cDNA消减杂交文库，鉴定出阳性克隆 后进行测序；11）根据步骤10）所获得的测序结果进行分析，确定候选的靶分子。