[发明专利]一种筛选人肿瘤相关的自然反义转录子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术、生物医药领域，具体地，本发明涉及一种筛选人肿瘤相关自然反义转录子的方法。

背景技术

自然反义转录子（natural antisense transcripts，以下称NAT）通常是指自然情况下生物体内生成的反义RNA（antisense RNA），它们与其对应的互补RNA（complementary RNA）通过互补碱基配对，形成双链的自然正义-反义转录子（natural sense-antisense transcript，以下称NSAT），引起靶基因的降解或翻译抑制来调控靶基因的表达。NAT按照其作用方式分为两种：大多数NAT来源于与正义转录子相同的基因组位点，由编码正义转录子的相对链所编码，称为顺式编码NAT（cis-NAT），这类分子与靶基因的序列完全互补；与此相反，来源于与正义转录子不同的基因组位点的NAT称为反式编码NAT（trans-NAT），它们与靶基因序列只是部分互补。

近年人们在研究NAT时发现，NAT表达水平的改变与人类肿瘤的发生和转移等密切相关，因此，NAT的异常表达被认为是研究肿瘤中不可忽视的重要因素。由于NAT的重要功能，目前国内外的多家研究机构对其进行了深入研究，发现自然界中可能存在的NAT远远超出我们最初的预期。这些研究大多采用生物信息学预测的方法，具有方便、快捷等优点，但所得结果不够可靠，且不能在特定的细胞或组织中系统筛选差异表达的NAT分子。为解决这些方法的局限和不足，我们利用双链RNA分子能够耐受RNaseI的降解，而单链RNA分子会被RNase I降解的原理，将提取的总RNA用RNase I酶切后再进行逆转录反应，就可以将在细胞内与靶分子以双链的NSAT（natural sense-antisense transcripts）形式存在的NAT分子从总RNA中分离出来，而且这种方法排除了人为干扰因素，理论上用该方法得到的NSAT应为自然条件下生物体内真实存在的。运用该原理，结合抑制性消减杂交等实验方法，我们就可以快速系统地筛选人正常细胞及对应的肿瘤细胞或正常组织及对应的癌组织间差异表达的NAT分子，从而获得人肿瘤相关的NAT分子。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于RNase保护分析及抑制性消减杂交的人肿瘤相关自然反义转录子的新型筛选方法。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种筛选人肿瘤相关的自然反义转录子的方法，包含以下步骤：

1）提取人正常细胞和对应的肿瘤细胞总RNA；

2）分别加入过量的DNase I和RNase I，酶切步骤1）获得的人正常细胞及对应的肿瘤细胞总RNA，然后通过酚/氯仿抽提回收；

3）以步骤2）中的双链RNA为模板，以随机六引物及逆转录酶将其反转录为cDNA；

4）以随机六引物为引物，用T4DNA聚合酶催化合成cDNA第二链并补平末端；

5）以Rsa I酶切双链cDNA，得到带有平末端的酶切产物，回收纯化后加双蒸水；

6）将步骤5）的检测子cDNA分为两份，一份连接SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，一份连接SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；驱动子(Driver)cDNA不连接头；

7）用T4DNA聚合酶补平粘末端，采用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀纯化后，加适量双蒸水溶解；

8）以正常细胞和癌细胞互为检测子和驱动子进行双向抑制性消减杂交；其中在正向消减中，以癌细胞为检测子，以正常细胞为驱动子；在反向消减中,以正常细胞为检测子，以癌细胞为驱动子；

9）将步骤8）的杂交产物用缓冲液稀释后作为模板进行两轮PCR扩增；PCR的引物核苷酸序列对应于SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；

10）将步骤9）PCR扩增后的正向和反向消减杂交产物纯化，后与pGEM-T载体连接克隆，并分别构建正向和反向cDNA消减杂交文库，鉴定出阳性克隆后进行测序；

11）根据步骤10）所获得的测序结果进行分析，确定候选的靶分子。

进一步地，步骤1）之后还包括检测所提取的总RNA的步骤。

进一步地，步骤3）中酶切条件为37℃水浴中酶切30min。

进一步地，步骤5）中酶切双链cDNA时间为2h。

进一步地，步骤5）中加双蒸水调整浓度至300ng/μl。

进一步地，步骤9）中两轮PCR扩增循环次数分别为28和12。