[发明专利]一种检测花生过敏成分Arah1的双抗体夹心ELISA方法

摘要

一种检测花生过敏成分Arah1的双抗体夹心ELISA方法，属于免疫分析技术领域。本发明首先从新鲜花生仁中获取含Arah1纯度较高的花生蛋白，用其免疫小鼠获得14株单抗，从中选择P/N值最大者的组合为最优组合。利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的，因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量（OD值），即可确定待测抗原含量。本发明直接、快速、高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的双抗体夹心ELISA法，检测花生过敏成分Arah1。

主权项

一种捡测花生过敏成分Arah1的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于：（1）酶标板的制备：所用的包被原是鼠抗Arah1单克隆抗体，所用包被缓冲液是0.05 M、pH9.6碳酸钠缓冲液，所用封闭液是含0.1％明胶的上述包被缓冲液；其中，鼠抗Arah1单克隆抗体是花生蛋白粗提取液免疫BALB/c小鼠制备；（2）酶标二抗是辣根过氧化物酶标记与一抗配对成功的鼠抗Arah1单克隆抗体；（3）洗涤液PBST的配方为：1000 mL蒸馏水中加入氯化钠8 g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠2.9 g、氯化钾0.2 g、吐温‑20  0.5mL；（4）标准品稀释液的配方为：在含30%体积甲醇的pH 6.5的PBS中加入质量比为5%的氯化钠；（5）显色液包括A液和B液，A液配方为每100 mL水中加入0.933 g柠檬酸，3.68 g Na2HPO4·12H2O，18 μL 30%H2O2；B液配方为60 mg四甲基联苯胺溶于100 mL乙二醇，使用时按A︰B=1︰1体积比使用；（6）终止液为2 mol/L的硫酸；检测步骤为： 1)以鼠抗Arah1单克隆抗体anti‑Arah1‑NO.8作为捕获抗体包被酶标板，100μL/孔，以0.05 M、pH 9.6的碳酸钠缓冲液为包被缓冲液，37℃孵育2h；2)洗板：包被后，将酶标板内容溶液洗掉，拍干，每孔加220μL洗涤液，放摇床上振动3min，倒掉拍干，再加洗液反复洗板三次；3)封闭：将板拍干后，每孔220μL封闭液，37℃孵育2h，洗板三次拍干，置37℃烘箱15min烘干备用；4)加受检标本，以NaCl含量为0.9%的0.01M pH 7.4的 PBS溶液稀释， 100μL/孔，37℃孵育0.5h，同法洗板拍干；5)加酶标鼠抗Arah1单克隆抗体HRP‑anti‑Arah1‑NO.5作为检测抗体，以含0.1%明胶的PBST为抗体稀释液，100μL/孔，37℃孵育0.5h，同法洗涤拍干；6)显色：每孔加入100 μL显色液，暗处37 ℃反应15 min，取出后每孔加入100 μL终止液，用酶标仪测定吸光值A450。