[发明专利]一种小麦麸皮抗冻蛋白的制备方法

摘要

一种小麦麸皮抗冻蛋白的制备方法，属于小麦加工副产物的综合利用技术领域。本发明以小麦麸皮为原料，经水提取、硫酸氨沉淀、离子交换色谱、凝胶过滤色谱和冷冻干燥等步骤，分离得到小麦麸皮抗冻蛋白。本发明首次介绍了从小麦麸皮中分离纯化抗冻蛋白的方法。所得小麦麸皮抗冻蛋白产品可用于农业、食品、医学等行业，从而实现小麦麸皮的有效增值和利用。

主权项

1、一种小麦麸皮抗冻蛋白的制备方法，其特征是以小麦麸皮为原料，用小麦麸皮质量/体积比10倍量的去离子水提取，所得提取液使用80％浓度的硫酸氨沉淀，将沉淀在抗冻蛋白提取液中复溶，浓缩，冻干，得小麦麸皮抗冻蛋白粗品；将小麦麸皮抗冻蛋白粗品再次在抗冻蛋白提取液中复溶，依次经过离子交换柱和凝胶过滤柱进行分离纯化，最终得到小麦麸皮抗冻蛋白，其纯度达到84.47％；工艺为：(1)去离子水提取：将小麦麸皮与10倍质量/体积比的去离子水混合，20℃，200转/分钟搅拌4小时，将混合液在2000g的离心力下离心30分钟，收集上清液；(2)用硫酸氨沉淀：向上清液中缓慢加入硫酸氨粉末，达到80％硫酸氨的饱和浓度，静置60分钟，将静置后的混合液在2000g的离心力下离心30分钟，收集沉淀；(3)复溶、透析、冻干得到粗品：将沉淀复溶于抗冻蛋白提取液中，将复溶的蛋白液放置于截留分子量为6000Da的透析袋中对抗冻蛋白提取液充分透析；透析后，使用聚乙二醇10000对透析袋进行浓缩，当浓缩到本次复溶液原体积的1/15时，停止浓缩，进行冷冻干燥，该冻干粉为小麦麸皮抗冻蛋白粗品；(4)粗品复溶：将小麦麸皮抗冻蛋白粗品复溶于抗冻蛋白提取液中，浓度为20mg/ml；(5)离子交换色谱纯化：用DEAE Sepharose Fast Flow柱，Φ30×300mm，对小麦麸皮抗冻蛋白粗品进行分离，分离首先使用流速1.2ml/min的抗冻蛋白提取液洗脱1小时，接着使用0-1.5M NaCl梯度洗脱5小时，流速为1.2ml/min，紫外检测器检测波长为280nm，收集图1中的P3馏分，将P3馏分放置于截留分子量为6000Da的透析袋中对抗冻蛋白提取液透析，透析后，使用聚乙二醇10000对透析袋进行浓缩，当浓缩到本次复溶液原体积的1/15时，停止浓缩，进行冷冻干燥，得到P3馏分冻干粉；(6)凝胶过滤色谱纯化：将P3馏分的冻干粉复溶于抗冻蛋白提取液中，使用Sephadex G75，Φ20×800mm，进一步进行分离，洗脱液为抗冻蛋白提取液，流速为0.8ml/min，收集图2中的P2馏分，将P2馏分放置于截留分子量为6000Da的透析袋中对抗冻蛋白提取液透析，透析后，使用聚乙二醇10000对透析袋进行浓缩，当浓缩到本次复溶液原体积的1/15时，停止浓缩，进行冷冻干燥，标记为P32，即为小麦麸皮抗冻蛋白冻干粉产品。