[发明专利]利用巢式PCR进行水牛胚胎性别鉴定的方法

摘要

本发明是一种利用PCR方法鉴定水牛胚胎性别的方法，根据水牛SRY基因测序结果设计三对引物，分别为SRY－HMG box特异性巢式引物和内参基因GAPDH引物，其中GAPDH引物用以扩增雌雄水牛共有的GAPDH基因(甘油醛脱氢酶基因)，以检测胚胎样品是否丢失；SRY－HMG box引物用以扩增雄性水牛特有的SRY基因保守段，用以鉴定胚胎性别。本发明在对水牛SRY全序列测序的基础上，设计的特异性引物能够稳定的扩增出相应基因序列，体系稳定，可大大提高检测的灵敏度和可行性。

主权项

1.利用巢式PCR(聚合酶链式反应)进行水牛胚胎性别鉴定，其特征是下列步骤组成：(1)在受精后第6、第7和第8天时回收囊胚，使用显微操作仪或手工切割获取少量胚胎样品，取样后的胚胎进行冷冻保存处理，然后置于液氮罐中贮存；(2)胚胎样品在无钙镁的PBS(磷酸缓冲液)中洗涤三次，转入PCR管中，加入细胞裂解液(Lysis Solution)，于室温放置5分钟，98℃灭活蛋白酶K后直接作为模板进行PCR反应；(3)在新的EP管中加入23μL PCR Mix液(包括PCR缓冲液，dNTP，Taq酶，去离子水)和上下游外引物、上下游内参引物(各50pM)，在PCR仪中预解链94℃ 2min，然后进行以下20循环：95℃ 20s；62℃ 30s；72℃ 30s，最后72℃延伸5min，停止反应；(4)取出1μL的PCR产物加入新管中，再加入22μL PCR Mix液(包括PCR缓冲液，dNTP，Taq酶，去离子水)、上下游内引物和上下游内参引物GAPDH(各50pM)，在PCR仪中预解链94℃ 2min，然后进行以下30循环：95℃ 20s；61℃ 30s；72℃ 30s，最后72℃延伸5min，停止反应；(5)将扩增产物于2％的琼脂糖凝胶电泳(100V，30min)，将凝胶置于EB(溴化己锭)中染色20分钟后于紫外灯下观察，凡在460bp和130bp出都出现条带的样品为雄性胚胎所有，只有460bp出现条带的为雌性胚胎，均未出现带的为丢失样品。1、根据权利要求1所述的胚胎性别鉴定技术，其特征在于步骤(3)中的外引物为：上游外引物5’AGG ACC ACA TCA AGC GAC CCA T 3’下游内引物5’CGG GTA TTT GTC TCT GTG TAT GG 3’2、根据权利要求1所述的利用巢式PCR进行水牛胚胎性别鉴定，其特征是步骤(4)中的内引物及内参引物为：上游内引物5’AGG CAG CTG GGC TAT GAG TGG AA 3’下游内引物5’CGG GTA TTT GTC TCT GTG TAT GG 3’上游内参引物5’GGT GAA GGT CGG AGT CAA CGG 3’下游内参引物5’GGT CAT GAG TCC TTC CAC GAT 3’