本发明涉及微生物领域,公开了自洽型P450酶及其制备方法、25‑羟基胆固醇或其衍生物的制备方法。该自洽型P450酶为具有如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的酶;或者为前述氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸残基且仍具有自洽型P450酶活性的氨基酸序列的酶;或者为与前述氨基酸序列具有80%以上同源性且具有自洽型P450酶活性的氨基酸序列所示的酶;或者为前述氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列的酶;或者为前述氨基酸序列的氨基末端连接有信号序列的氨基酸序列的酶。该自洽型P450酶具有显著提高的转化胆固醇或其衍生物的能力。