本发明涉及酶工程技术领域，尤其涉及耐高温的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶及其应用，该耐高温的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7所示。本发明中的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶TsDAE2，其最适温度为85℃，在80℃条件下的半衰期大于11h，其热催化性能明显优于目前已报导的同类酶。该D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶TsDAE2的最适pH为5.5，在酸性条件下和嗜热葡萄糖异构酶偶联催化500g/L葡萄糖异构化制备D‑阿洛酮糖，反应达到平衡时，D‑阿洛酮糖的终浓度为115g/L，反应液色度为0RBU，基本没有发生美拉德反应。由于本发明采用一步法生产D‑阿洛酮糖，能大幅降低能耗和分离纯化成本，在D‑阿洛酮糖生产等食品加工领域具有应用潜力。
