本发明涉及一种用于鉴定义乌小鲵的多重PCR引物、试剂盒、方法、应用,所述多重PCR引物包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的第一引物对,以及包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的第二引物对。所述鉴定方法包括:提取待鉴定样品的基因组DNA;以所述基因组DNA为模板DNA,采用所述的多重PCR引物对所述模板DNA进行PCR扩增,得到扩增产物;将所述扩增产物进行凝胶电泳,根据扩增条带分析结果,若所述扩增条带为906bp和417bp的二条带时,则判断所述待鉴定样品为来自义乌小鲵的样品。该鉴定方法准确度高,且检测时间短、操作简便,经济实用。