本发明公开了构建MKRN3基因突变的先天性中枢性性早熟模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。本发明提供了一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将SEQ ID NO：16所示MKRN3‑gRNA3、SEQ ID NO：17所示MKRN3‑gRNA4和NCN蛋白共转染猪细胞，得到重组细胞。本发明采用CRISPR/Cas9技术联合双gRNA编辑进行了MKRN3基因的敲除，模拟中枢性性早熟、中枢性性早熟合并肺癌的自然发病遗传特征，并获得了MKRN3基因敲除的单细胞克隆，为后期通过体细胞核移植动物克隆技术培育中枢性性早熟、中枢性性早熟合并肺癌的模型猪奠定了基础。本发明对于中枢性性早熟、中枢性性早熟合并肺癌的药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。
本发明公开了用于构建SOD1基因突变的ALS模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。本发明提供了一种制备重组细胞的方法：将SOD1‑gRNA1(靶序列结合区如SEQ ID NO：18中第3‑22位核苷酸所示)、SOD1‑gRNA6(靶序列结合区如SEQ ID NO：19中第3‑22位核苷酸所示)、SOD1‑mutant‑ss160(SEQ ID NO：20所示)和NCN蛋白(Cas9蛋白或具有Cas9蛋白的融合蛋白)共转染猪细胞，得到重组细胞。本发明采用CRISPR/Cas9技术联合ssODN同源重组技术进行了SOD1基因的点突变基因编辑，模拟ALS的自然发病遗传特征，并获得了SOD1基因精确点突变的单细胞克隆，为后期通过体细胞核移植动物克隆技术培育ALS疾病模型猪奠定了基础。
本发明公开了一种基因编辑系统及其在构建OCA‑1B型白化病模型猪核移植供体细胞中的应用。本发明提供的试剂盒，包括靶序列结合区如SEQ ID NO：18中第3‑22位核苷酸所示的TYR‑gRNA1、靶序列结合区如SEQ ID NO：19中第3‑22位核苷酸所示的TYR‑gRNA5、SEQ IDNO：20所示的TYR‑E4mut‑ss153和NCN蛋白；试剂盒的用途：制备重组细胞；制备白化病模型猪；制备白化病细胞模型或白化病组织模型或白化病器官模型。将所述重组细胞作为核移植供体细胞进行体细胞克隆，可以得到克隆猪，即为白化病模型猪。本发明对于白化病药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。
本发明公开了用于构建HBB基因突变的镰刀型细胞贫血症模型猪核移植供体细胞的方法及应用。本发明提供了HBB‑gU1、HBB‑gD3、HBB‑mutant‑ss174和NCN蛋白在制备试剂盒中的应用。试剂盒的用途：制备重组细胞；制备镰刀型细胞贫血症模型猪；制备镰刀型细胞贫血症细胞模型或镰刀型细胞贫血症组织模型或镰刀型细胞贫血症器官模型。HBB‑gU1为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：18中第3‑22位核苷酸所示。HBB‑gD3为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：19中第3‑22位核苷酸所示。HBB‑mutant‑ss174为SEQ ID NO：20所示的单链DNA分子。NCN蛋白为Cas9蛋白或具有Cas9蛋白的融合蛋白。本发明对于研发镰刀型细胞贫血症药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。
本发明公开了用于构建OCA‑1A型白化病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。本发明提供了一种制备重组细胞的方法：用SEQ ID NO：18所示的DNA分子取代猪细胞的染色体DNA中SEQ ID NO：19所示的DNA分子，得到重组细胞。实现方式：将靶序列结合区如SEQ ID NO：16中第3‑22位核苷酸所示的TYR‑gRNA1、靶序列结合区如SEQ ID NO：17中第3‑22位核苷酸所示的TYR‑gRNA2、SEQ ID NO：18所示的TYR‑E1mut‑ss126和NCN蛋白共转染猪细胞。本发明对于研发OCA‑1A型白化病药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。
本发明公开了一种构建MRAP2基因突变的重症早发性肥胖症模型猪核移植供体细胞的方法。本发明提供了试剂盒，包括SEQ ID NO：16所示MRAP2‑gRNA2、SEQ ID NO：17所示MRAP2‑gRNA3、SEQ ID NO：18所示MRAP2‑mutant‑ss130和具有Cas9蛋白的融合蛋白。本发明还提供了一种制备重组细胞的方法：将MRAP2‑gRNA2、MRAP2‑gRNA3、MRAP2‑mutant‑ss130和NCN蛋白共转染猪细胞，从而用SEQ ID NO：18所示的DNA分子取代猪细胞的染色体DNA中SEQ ID NO：19所示的DNA分子。本发明对于治疗肥胖症药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。
本发明公开了用于构建vWF基因突变的血管性血友病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。本发明提供了SEQ ID NO：15所示gRNA‑vWF‑gU2、SEQ ID NO：16所示gRNA‑vWF‑gD1和NCN蛋白在制备试剂盒中的应用。NCN蛋白为Cas9蛋白或具有Cas9蛋白的融合蛋白。试剂盒的用途：制备重组细胞；制备血管性血友病模型猪；制备血管性血友病细胞模型或血管性血友病组织模型或血管性血友病器官模型。本发明还提供了一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将gRNA‑vWF‑gU2、gRNA‑vWF‑gD1和NCN蛋白共转染猪细胞，得到重组细胞。本发明对于血管性血友病药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。
本发明公开了用于构建CRYBB2基因突变的先天性白内障疾病模型猪核移植供体细胞的方法和系统。本发明提供了一种试剂盒，包括SEQ ID NO：18所示CRYBB2‑gRNA3、SEQ ID NO：19所示CRYBB2‑gRNA6和NCN蛋白。NCN蛋白为Cas9蛋白或具有Cas9蛋白的融合蛋白。试剂盒的用途：制备重组细胞；制备白内障模型猪；制备白内障细胞模型或白内障组织模型或白内障器官模型。本发明还提供了一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将CRYBB2‑gRNA3、CRYBB2‑gRNA6和NCN蛋白共转染猪细胞，得到重组细胞。本发明对于白内障药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。
本发明公开了构建CRYGC基因突变的先天性白内障模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。本发明提供了一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将SEQ ID NO：18所示CRYGC‑gRNA1、SEQ ID NO：19所示CRYGC‑gRNA4和NCN蛋白共转染猪细胞，得到重组细胞。本发明采用CRISPR/Cas9技术联合双gRNA编辑进行了CRYGC基因的敲除，模拟白内障的自然发病遗传特征，并获得了CRYGC基因敲除的单细胞克隆，为后期通过体细胞核移植动物克隆技术培育白内障模型猪奠定了基础。本发明对于白内障药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。
本发明公开了用于构建三基因(GHR基因、IGF1基因和IGF2基因)联合突变的小型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。本发明提供了一种试剂盒，包括SEQ ID NO：36所示GHR‑E5‑gRNA2、SEQ ID NO：37所示GHR‑E5‑gRNA3、SEQ ID NO：38所示IGF1‑E4‑gRNA1、SEQ ID NO：39所示IGF1‑E4‑gRNA2、SEQ ID NO：40所示IGF2‑E4‑gRNA2、SEQ ID NO：41所示IGF2‑E4‑gRNA7和NCN蛋白。NCN蛋白为Cas9蛋白或具有Cas9蛋白的融合蛋白。本发明采用CRISPR/Cas9技术联合双gRNA编辑进行了GHR基因、IGF1基因和IGF2基因的联合敲除，并获得了三个基因联合敲除的单细胞克隆，为后期通过体细胞核移植动物克隆技术培育小型猪及生长发育障碍或迟缓模型猪奠定了基础。
本发明公开了构建DOK7基因突变的肌无力疾病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。本发明提供了SEQ ID NO：16所示DOK7‑gRNA2、SEQ ID NO：17所示DOK7‑gRNA4和NCN蛋白在制备试剂盒中的应用。本发明还提供了一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将DOK7‑gRNA2、DOK7‑gRNA4和NCN蛋白共转染猪细胞，得到重组细胞。所述重组细胞为DOK7基因发生突变的重组细胞。以上任一所述试剂盒的用途为：制备重组细胞；制备肌无力模型猪；制备肌无力细胞模型或肌无力组织模型或肌无力器官模型。本发明对于肌无力疾病药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。
本发明提供了一种表达人FUS蛋白的猪细胞和由该猪细胞通过体细胞克隆技术获得的肌萎缩侧索硬化症模型猪及其构建方法和在生物医药领域的应用。其中，将编码人FUS蛋白的核苷酸序列插入猪安全港位点，获得表达SEQ ID NO：14所示的人FUS蛋白的猪细胞和肌萎缩侧索硬化症模型猪，所述的猪安全港位点选自猪ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位点。本申请研究对象应用性好，猪细胞中目的基因的表达量高、基因编辑效率高。
