本发明公开了一种一步法巢式荧光定量PCR检测鼠源细胞中MVM的引物探针、试剂盒及方法。该引物探针的序列分别如SEQ ID NO.1~5所示。本发明提供的试剂盒含有前述引物探针。本发明通过提取待测样品上清中的DNA,加入前述引物探针,进行一步法巢式荧光定量PCR反应,将目的Ct值代入标准曲线,得到待测样品中病毒DNA的拷贝数。本发明能够检测到所有MVM亚型,特异性好,灵敏度高、重复性好,能够快速、准确稳定地检测鼠源细胞培养上清中可能存在的MVM污染,可检测的最低浓度是10拷贝数/反应的病毒。为快速灵敏地检测鼠源细胞中的MVM污染提供了技术手段,对目前的生物制品生产具有重要的意义。