本发明公开了一种L‑氨基酸脱氢酶突变体及其编码基因、基因工程菌及其在制备L‑草铵膦中的应用，该L‑氨基酸脱氢酶突变体包括：以SEQ ID NO.1所示野生型的L‑氨基酸脱氢酶为模板，第354位的V替换为G所得突变体；第152位的A替换为G所得突变体；第152位和第354位联合突变形成的突变体；第156位的N突变成A与第152位、第354位联合突变形成的突变体。本发明通过分子改造，获得了一类在催化2‑羰基‑4‑(羟甲基膦酰基)丁酸制备L‑草铵膦工艺中具有高酶活的L‑氨基酸脱氢酶突变体，使用全细胞对500mM底物PPO进行转化时，底物转化率在4小时内可以达到99％以上，具有很强的工业应用前景。
本发明公开了一种P450酶突变体、单质粒三酶共表达系统及其在骨化二醇合成中的应用。P450酶突变体包括：以SEQ ID NO.1所示野生型P450酶CYP109E1为模板，分别对第78位的T突变或第81位的G突变，形成的突变体T78A、T78V、T78L和T78I，G81V和G81M，以及同时对第78位的T和第81位的G突变，形成的突变体T78L/G81M。本发明还通过构建一种P450酶突变体和氧化还原伴侣的单质粒三酶共表达系统，提高了P450酶羟基化反应中的电子传递效率，可在温和条件下以更高效率合成骨化二醇，解决了P450酶催化合成骨化二醇催化效率以及活力低的问题，具有重要的工业应用价值。
本发明公开了一种亮氨酸脱氢酶突变体及其在制备L‑苯甘氨酸中的应用。该亮氨酸脱氢酶突变体为：以SEQ ID NO.1所示的野生型亮氨酸脱氢酶MsLDH为模板，第332位的天冬氨酸D突变为谷氨酸E，第333位的甘氨酸G突变为谷氨酸E，第334位的亮氨酸L突变为精氨酸R所得的突变体MsLDH‑EER，氨基酸基序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过分子改造获得一种催化活力和pH稳定性均提高的亮氨酸脱氢酶突变体MsLeuDH，相较于野生型MsLeuDH在200mM底物浓度下4h时转化率为68.0％，根据本发明提供的突变体MsLDH‑EER在3h时转化率达到99.5％，产物e.e.值大于99％。
本发明公开一种亚胺还原酶突变体、重组基因工程菌及其在(R)‑2‑甲基吡咯烷合成中的应用。所述亚胺还原酶突变体以SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的野生型亚胺还原酶IR23为模板，第249位缬氨酸突变获得的突变体V249T，第249位缬氨酸和第224位色氨酸突变获得的突变体V249T/W224F。本发明通过半理性设计的分子改造方法，显著提高了亚胺还原酶催化环状亚胺2‑甲基吡咯啉生成相应环状胺的能力。突变体V249T/W224F催化2‑甲基吡咯啉时，底物转化率为93.3％，与野生型相比提高了49.8％。本发明有效提高了亚胺还原酶不对称合成手性胺的能力，对手性胺化合物的绿色催化合成具有重要意义。
本发明公开了一种醇脱氢酶突变体、基因工程菌及其应用。该醇脱氢酶突变体包括：以SEQ ID NO.1所示野生型的醇脱氢酶y29为模板，第196位的亮氨酸L突变为甲硫氨酸M的突变体L196M，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；第196位的亮氨酸L突变为甲硫氨酸M，第153位的酪氨酸Y突变为苯丙氨酸F的醇脱氢酶突变体L196M/Y153F，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。与野生型醇脱氢酶相比，本发明提供的醇脱氢酶突变体可高活性、高立体选择性催化底物4‑氯乙酰乙酸乙酯(COBE)制备(S)‑CHBE，且以廉价的异丙醇作为共底物实现辅酶高效循环，具有很好的工业应用前景。
