本发明提出鉴别MG的TS‑11疫苗株和野毒株的引物探针组合、方法及应用。其引物探针组合包括共同上游引物、共同下游引物、TS‑11疫苗株探针和野毒株探针,共同上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,共同下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示;TS‑11疫苗株探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,野毒株探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示;TS‑11疫苗株探针和所述野毒株探针的5’端均标以荧光报告基团,TS‑11株探针和所述野毒株探针的3’端均标以荧光淬灭基团。该引物探针组合和采用该引物探针组合的Cycleave荧光PCR检测方法能够准确、高效的鉴别TS‑11疫苗株和野毒株,且具有高灵敏度、特异性、简单易操作的优点。