本发明公开了一种原位监测胞内ATP含量传感器的构建方法及其应用。一种能够原位监测贵州木霉NJAU 4742胞内ATP含量的传感器,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所涉及的ATP传感器,主要包括青色荧光蛋白片段(CFP)和黄色荧光蛋白片段(YFP)以及ATP识别基团;以质粒pcDNA为模板,扩增含有HygB、基因启动子、终止子和线性化表达载体片段;利用一步克隆法将ATP传感器片段与线性化表达载体连接,形成具有潮霉素抗性的ATP荧光示踪工作原件质粒。本发明中ATP传感器,将为提高丝状真菌胞内ATP含量的精准监测和调控提供充实的理论和应用基础。