本发明公开了预包装饮用水中两种致病菌的双重荧光定量PCR检测方法及试剂盒。所述试剂盒包含检测铜绿假单胞菌和粪链球菌的引物及探针(SEQ ID NO:1‑6)。本发明试剂盒特异性好,检测方法快速简单,准确性高,灵敏度好,为预包装饮用水中铜绿假单胞菌和粪链球菌两种致病菌检测提供了新的方法。本发明提供的双重荧光定量PCR法可以准确快速地实现饮用水中铜绿假单胞菌和粪链球菌的检测,1天内即可完成检测,具有快速、特异、敏感、高通量、稳定性好、节约试剂成本等优点,适用于饮用水标准中铜绿假单胞菌和粪链球菌两种致病菌指标。