本发明属于基因工程技术领域,涉及一种烟草转录因子NtMYB305及其在调控烟草烟碱生物合成中的应用,包括烟草转录因子NtMYB305,编码基因如SEQ ID NO:1所示;其同源基因NtMYB305a.1、NtMYB305a.2、NtMYB305b.1、NtMYB305b.2分别由SEQ ID NO:2‑5所示核苷酸序列组成。本发明提供了烟草转录因子NtMYB305及其编码基因在调控烟草烟碱生物合成中的应用,通过超表达及基因沉默技术等基因工程手段对该基因在烟草植株内进行上调或下调表达,可以显著提高或降低烟草烟碱的含量,为未来培育高烟碱含量和低烟碱含量的转基因烟草品种提供新的思路和方法。