本发明适用于基因工程技术领域,提供了一种减毒鰤鱼诺卡氏菌及其制备方法和应用,该减毒鰤鱼诺卡氏菌为缺失血红素蛋白相关蛋白基因的鰤鱼诺卡氏菌菌株;其中,血红素蛋白相关蛋白基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示,血红素蛋白相关蛋白基因对应的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。本发明提供的减毒鰤鱼诺卡氏菌,可用作疫苗或免疫佐剂;其通过基因敲除的方法缺失血红素蛋白相关蛋白基因后,能有效降低细菌的致病性,但仍保留了较好的免疫原性。另外,由于本发明是在鰤鱼诺卡氏菌基因组上直接进行敲除,菌内不含抗性质粒,符合生物安全,并且不会因为质粒的丢失而影响鰤鱼诺卡氏菌的生长。