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[发明专利]一种防治禽流感H5N1的重组杆状病毒疫苗的制备方法-CN201610081479.5有效
发明人：葛菁萍;平文祥;高冬妮;安琪;刘颖;白程乐;于航 -专利权人：黑龙江大学
申请日： 2016-02-04 - 公布日： 2020-06-12 - 主分类号： C12N7/01 文献下载
摘要：本发明涉及一种防治禽流感H5N1的重组杆状病毒疫苗的制备方法，具体涉及一种表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组H5N1病毒疫苗株及其制备方法，具体包含以下步骤：1)pS‑ITRs‑HA质粒的构建，2)pS‑ITRs‑HA质粒转化E.coli DH10 Bac，3)重组杆状病毒穿梭载体转染Sf9昆虫细胞，4)重组杆状病毒的扩增。制备获得的重组H5N1病毒疫苗株对免疫鸡的血清进行免疫检测，免疫鸡血清中IgG抗体的水平最高可达0.966，IL‑2、IL‑4和IFN‑γ的浓度最高可分别达到89.67ng/L、80.21ng/L和64.24ng/L，以上结果表明重组杆状病毒疫苗可有效的刺激鸡体同时产生体液免疫和细胞免疫，为鸡群提供了双重免疫保护作用，本发明为基于杆状病毒的禽流感疫苗的研发奠定理论基础。
一种防治禽流感 h5n1 重组杆状病毒疫苗制备方法

[发明专利]副干酪乳杆菌HD1.7prcR基因siRNA-CN201510259659.3有效
发明人：葛菁萍;孙艳阳;王洋;高冬妮;平文祥 -专利权人：黑龙江大学
申请日： 2015-05-20 - 公布日： 2017-12-08 - 主分类号： C12N15/113 文献下载
摘要：副干酪乳杆菌HD1.7prcR基因siRNA，它涉及副干酪乳杆菌基因的siRNA分子。它解决构建自杀质粒难度大，同源臂的长短依赖目的基因的长短，不利于同源重组的发生等问题。siRNA‑R1核苷酸序列为5'‑AUACCCAACAUUGUUUCGCTT‑3'。siRNA‑R2核苷酸序列为5'‑AUGCAGAACGCGAAAUCGCTT‑3'。本发明的两种siRNA分子都能够高效的阻断副干酪乳杆菌HD1.7prcR基因的表达，从而降低副干酪乳杆菌HD1.7细菌素的产量。
干酪杆菌 hd1 prcr 基因 sirna

[发明专利]高产细菌素的副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法-CN201610157858.8在审
发明人：葛菁萍;高冬妮;孙艳阳;王洋;李兴霖;纪晓磊;杨睿睿;平文祥 -专利权人：黑龙江大学
申请日： 2016-03-18 - 公布日： 2016-07-13 - 主分类号： C12N15/74 文献下载
摘要：高产细菌素的副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法，涉及一种副干酪乳杆菌基因工程菌株的构建方法。本发明是要解决现有副干酪乳杆菌的细菌素产量低的问题。方法：一、从副干酪乳杆菌HD1.7中扩增prcK基因；二、构建质粒pMD18‑T‑prcK；三、构建重组过表达载体pRSFDuet‑1‑prcK；四、构建重组过表达载体pRR‑tet；五、将过表达载体pRR‑tet电转化副干酪乳杆菌HD1.7感受态细胞；六、prcK基因过表达突变株的筛选和鉴定。该基因工程菌株的抑菌能力比原始菌株提高了17.86％。传代后发酵液细菌素效价2373.46±46.27AU/mL，传代后效价比较稳定。本发明用于产细菌素。
高产细菌干酪杆菌基因工程菌株构建方法

[发明专利]副干酪乳杆菌HD1.7prcK基因siRNA-CN201510259660.6在审
发明人：葛菁萍;王洋;孙艳阳;高冬妮;平文祥 -专利权人：黑龙江大学
申请日： 2015-05-20 - 公布日： 2015-08-19 - 主分类号： C12N15/113 文献下载
摘要：副干酪乳杆菌HD1.7prcK基因siRNA，它涉及副干酪乳杆菌基因的siRNA分子。它解决构建自杀质粒难度大，同源臂的长短依赖目的基因的长短，不利于同源重组的发生等问题。siRNA-K1核苷酸序列为5'-GCAACGCUCCAACUUUCAUTT-3'。siRNA-K2核苷酸序列为5'-CCAACUUUCAUUGCAACAATT-3'。本发明的两种siRNA分子都能够高效的阻断副干酪乳杆菌HD1.7prcK基因的表达，从而降低副干酪乳杆菌HD1.7细菌素的产量。
干酪杆菌 hd1 prck 基因 sirna

[发明专利]一种厌氧微生物培养基复合去氧层-CN201510149249.3在审
发明人：赵丹;高冬妮;范晓旭;宋刚;凌宏志 -专利权人：黑龙江大学
申请日： 2015-04-01 - 公布日： 2015-06-10 - 主分类号： C12N1/20 文献下载
摘要：一种厌氧微生物培养基复合去氧层。它涉及一种培养基去氧层。它解决了现有厌氧培养基无法完全去除氧，还原剂存在影响或危害厌氧微生物生长的风险，以及厌氧培养罐和厌氧培养箱结构复杂，购置和维持运行成本高，携带不方便等问题。氧微生物培养基复合去氧层由下而上依次为无菌硅胶塞、含有培养基成分的无菌琼脂、还原剂和无菌琼脂；且无菌硅胶塞上设置有竖直贯通的细孔。本发明厌氧微生物培养基复合去氧层制作简单，设备要求低，成本低廉，方便携带和临时制作，而且除氧效果好，特别适合在传染病原监测、工业微生物初筛等领域应用。
一种厌氧微生物培养基复合去氧层

[发明专利]HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法-CN201210093071.1无效
发明人：葛菁萍;高冬妮;宋刚;凌宏志;平文祥;楼庄伟;唐晓艳;金丽颖;安琪;叶磊 -专利权人：黑龙江大学
申请日： 2012-03-31 - 公布日： 2012-10-03 - 主分类号： C12N15/66 文献下载
摘要：HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，涉及基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。它解决了目前新城疫的病毒疫苗存在成本高的问题。方法：一、以pNDV-F-T为模板PCR扩增，目的片段进行TA克隆及连接，得pTYL-HA-F，酶切得HA-F片段；二、六种质粒分别单酶切及去磷酸化处理，然后进行纯化；三、连接后得六种重组转移载体；四、转化感受态细胞，经提取后得Bacmid-YL；五、转染sf9细胞，得六种重组杆状病毒即完成。本发明利用杆状病毒表达系统，使其直接在中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1内表达HA-F抗原蛋白；为制备鸡新城疫基因工程疫苗奠定了基础，以此制备的新城疫病毒疫苗成本可有效降低。
ha ndv 基因重组杆状病毒表达载体构建方法

[发明专利]HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法-CN201210093043.X无效
发明人：葛菁萍;高冬妮;宋刚;凌宏志;平文祥;楼庄伟;唐晓艳;金丽颖;安琪;田兆峰 -专利权人：黑龙江大学
申请日： 2012-03-31 - 公布日： 2012-08-01 - 主分类号： C12N15/866 文献下载
摘要：HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，涉及基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。它解决了目前杆状病毒介导的外源基因在CHO细胞中的表达率较低的问题。方法：一、以pMD18-T-VP2为模板进行PCR扩增，获得目的片段进行TA克隆及载体连接，得pTZF-HA-VP2；二、九种质粒和pTZF-HA-VP2分别进行双酶切，酶切后的目的片段进行连接，得九种重组转移载体；三、九种重组转移载体分别转化感受态细胞，经提取后得rBac-TZF-X；四、rBac-TZF-X转染sf9细胞，得rBV-TZF-X即完成。本发明添加调控元件WPRE可以提高杆状病毒介导外源基因在CHO细胞中的表达率。
ha vp2 基因重组杆状病毒表达载体构建方法

[发明专利]具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法-CN201210093206.4无效
发明人：葛菁萍;高冬妮;宋刚;凌宏志;平文祥;楼庄伟;唐晓艳;安琪;金丽颖 -专利权人：黑龙江大学
申请日： 2012-03-31 - 公布日： 2012-08-01 - 主分类号： C12N15/866 文献下载
摘要：具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，涉及可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法。方法：酶切pcDNA3.1(-)；酶切pFastBac1；二者连接得pFastBac1-pcDNA3.1(-)；pEGFP-C3进行扩增，产物经纯化后于T-Vector连接得pMD-EGFP；pFastBac1-pcDNA3.1(-)和pMD-EGFP分别酶切，再连接，得pFastBac1-pcDNA3.1(-)-EGFP；制Bacmid-EGFP；转染sf9细胞，得CN-EGFP即完成。本发明首次利用杆状病毒表达载体系统在OL细胞中导入并表达外源基因，拓宽了杆状病毒可转导的哺乳动物细胞范围。
具有 cmv 启动子表达 egfp 重组杆状病毒构建方法

[发明专利]一种检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法-CN201210065532.4无效
发明人：葛菁萍;宋刚;凌宏志;赵丹;高冬妮;柴洋洋;陈丽 -专利权人：黑龙江大学
申请日： 2012-01-13 - 公布日： 2012-07-18 - 主分类号： C12Q1/68 文献下载
摘要：一种检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法，涉及一种检测传统豆酱发酵过程中真菌多样性的方法。是要解决传统的检测豆酱发酵过程中真菌多样性的方法工作量大，检测结果不准确的问题。方法：称取豆酱样品，加入到磷酸盐缓冲液中悬浮，再加入玻璃珠振荡，离心，收集上清液；将沉淀洗涤，离心，收集上清液；离心弃上清，将沉淀用洗涤，得菌体，向菌体中加磷酸盐缓冲液吹打至悬浮，振荡，得预处理的样品；抽提预处理的样品中的真菌基因组DNA；PCR扩增得产物A；将产物A稀释，PCR扩增得产物B；以产物B作为上样样品，使用变性梯度凝胶电泳装置进行电泳，即完成。本发明方法简单、灵敏度高、可重复性和可靠性好，全面反应菌群结构多样性。
一种检测传统豆酱发酵过程真菌多样性方法

[发明专利]具有CBA启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法-CN201210012796.3无效
发明人：葛菁萍;高冬妮;平文祥;楼庄伟 -专利权人：黑龙江大学
申请日： 2012-01-16 - 公布日： 2012-07-04 - 主分类号： C12N15/866 文献下载
摘要：具有CBA启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，涉及一种具有CBA启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法。解决现有重组杆状病毒介导的基因表达效率低的问题。方法：依次构建pMD18-T-GV、pFastBac1-GV、pGM18-T-pHGV、pMD18-T-CBA、pFastBac[pH-]-pHBOX、pSD-CBA、pSD、pSD-L-ITR和pSD-ITRs；构建pMD18-T-EGFP；构建pSD-EGFP；构建pSD-ITRs-EGFP；转化DH10Bac细胞，获得重组载体；转染，获得重组杆状病毒。经过修饰改造的重组杆状病毒所介导的EGFP基因的表达效率明显增强。
具有 cba 启动子表达 egfp 重组杆状病毒构建方法

[发明专利]EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法-CN201210012811.4无效
发明人：葛菁萍;高冬妮;平文祥;楼庄伟 -专利权人：黑龙江大学
申请日： 2012-01-16 - 公布日： 2012-07-04 - 主分类号： C12N15/866 文献下载
摘要：EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，涉及EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。是要解决目前重组杆状病毒质粒载体转导效率低、表达效率较工业生产要求差距大、表达时间短等问题。方法；一、PCR扩增EF1α基因；二、构建质粒pT-EF1α；三、构建质粒pWK；四、PCR扩增L-ITR基因，构建pWK-L-ITR；五、PCR扩增R-ITR基因，构建pWK-ITR；六、PCR扩增EGFP基因，构建EGFP基因重组杆状病毒表达载体pWK-ITR-EGFP。本发明通过添加VSV-GED、WPRE和ITR元件，增强了外源基因的表达效率，增强了病毒的转导效率，延长了表达时间。
egfp 基因重组杆状病毒表达载体构建方法

[发明专利]一种可产生β-甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌-CN200910073473.3无效
发明人：葛菁萍;平文祥;宋刚;凌宏志;赵丹;高冬妮 -专利权人：黑龙江大学
申请日： 2009-12-22 - 公布日： 2011-05-25 - 主分类号： C12N1/20 文献下载
摘要：一种可产生β-甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌，它涉及一种地衣芽孢杆菌。解决了现在利用真菌产生β-甘露聚糖酶存在酶活低的问题。可产生β-甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌属于地衣芽孢杆菌新种，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2009年11月29日，保藏编号为CGTCC No.M209288；可产生β-甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌为革兰氏阳性兼性厌氧杆菌，宽为0.5～0.8μm，长为1.5～2.0μm，无鞭毛、中生椭圆形芽孢。本发明中地衣芽孢杆菌所产的β-甘露聚糖酶经测试为酸性甘露聚糖酶，分子量约为38kD，该酶表现出较好的耐高温活性，最高酶活性达5168U/mL。
一种产生甘露聚糖地衣芽孢杆菌

[发明专利]一种工业发酵酸菜的方法-CN200910073143.4有效
发明人：葛菁萍;平文祥;凌宏志;宋刚;赵丹;高冬妮 -专利权人：黑龙江大学
申请日： 2009-11-06 - 公布日： 2010-04-28 - 主分类号： A23B7/10 文献下载
摘要：一种工业发酵酸菜的方法，它涉及一种发酵酸菜的方法。它解决了目前大规模工厂生产的酸菜仍沿袭了传统工艺，依靠自然发酵，发酵罐中的白菜极易受到杂菌的污染，导致腐烂、变质的问题。方法：一、码放白菜；二、投加酸菜发酵工程菌；三、加入盐水注满发酵罐；四、发酵，即获得酸菜成品。本发明方法采用人为可控的工业化工艺发酵酸菜，所加入的成分均为已知、可控，因此避免了白菜受杂菌污染，腐烂、变质的情况。
一种工业发酵酸菜方法

[发明专利]传统发酵豆酱中细菌的检测方法-CN200910072449.8无效
发明人：葛菁萍;蔡柏岩;平文祥;宋刚;赵丹;高冬妮;凌宏志;陈丽 -专利权人：黑龙江大学
申请日： 2009-07-02 - 公布日： 2010-01-06 - 主分类号： C12Q1/68 文献下载
摘要：传统发酵豆酱中细菌的检测方法，它涉及一种豆酱中细菌的检测方法。它解决了目前的PCR-DGGE技术无法准确的检测传统发酵豆酱中细菌的问题。检测方法：一、传统发酵豆酱样品细菌总基因组DNA提取；二、PCR扩增细菌16S rDNA的V3区；三、细菌PCR-DGGE。本发明方法在彻底清除传统发酵豆酱中微生物细胞之外其它成分的同时，尽可能的避免了微生物种类和数量的流失，而且整个检测过程中不改变DNA的含量，减小了最终分析偏差，保证了检测结果的准确性。
传统发酵豆酱细菌检测方法

[发明专利]一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法-CN200810064831.X有效
发明人：平文祥;葛菁萍;凌宏志;宋刚;杜春梅;赵丹;高冬妮;曹喜生 -专利权人：黑龙江大学
申请日： 2008-06-30 - 公布日： 2008-11-12 - 主分类号： C12N15/66 文献下载
摘要：一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法，它涉及一种质粒载体的构建方法。它解决了目前经代谢工程改造后的酿酒酵母木糖利用率仍然很低，且发酵副产物木糖醇产生量高的问题。构建方法：先克隆KanR基因、XKS1基因、ADH1终止子片段、酿酒酵母中2.2kb rDNA片段；然后回收、纯化基因片段与pGEMT Easy载体连接；再依次构建质粒pR、质粒pRK和质粒pRKT；最后将2.2kb rDNA片段加入质粒pRKT。本发明方法所构建的载体可以将XKS1基因高拷贝整合到酿酒酵母的染色体基因组上，实现XKS1的超量稳定表达，疏通了酿酒酵母利用木糖产乙醇的木糖代谢流，提高了木糖的利用率，降低了副产物木糖醇的产量。
一种表达木酮糖激酶基因质粒构建方法

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