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[发明专利]基于PLIN1基因的sgRNA、质粒载体及其构建方法和应用-CN202010671855.2有效
发明人：彭玥晗;鞠辉明 -专利权人：扬州大学
申请日： 2020-07-13 - 公布日： 2022-09-23 - 主分类号： C12N15/113 文献下载
摘要：本发明公开了一种基于PLIN1基因的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。本发明还公开了扩增该sgRNA序列的引物对、基于PLIN1基因的CRISPR/Cas9敲除质粒载体及其应用。本发明的构建了控制猪PLIN1基因表达的载体及验证其相应的敲除效率。本发明还提供三种用于控制猪PLIN1表达的载体并验证其敲除效率并选出一种最优敲除载体，通过所述载体能够控制猪细胞中的PLIN1表达量，进而控制猪的肌肉的纤维组成，调节瘦肉率的变化。本发明还验证了该PLIN1基因敲除后的线粒体活性氧含量有所升高、线粒体膜电位检测升高、ATP含量降低、细胞周期发生阻滞，而细胞凋亡率大大降低。
基于 plin1 基因 sgrna 质粒载体及其构建方法应用

[发明专利]基于多位点同时敲除的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用-CN202110084936.7在审
发明人： 鞠辉明;徐磊 -专利权人：扬州大学
申请日： 2021-01-21 - 公布日： 2022-01-28 - 主分类号： C12N15/85 文献下载
摘要：本发明公开了pCMV‑Cas9‑4xsgRNA表达载体，所述表达载体包含Cas9蛋白、EGFP标记和4个表达sgRNA功能域的表达载体。本发明还公开了基于多位点同时敲除的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。该载体整合了Cas9表达框和四个可以通过不同限制性内切酶酶切重组的sgRNA，能够高效简便地在众多真核生物细胞中实现至多四个sgRNA同时发挥作用，实现两个基因四个靶点的敲除或同时敲除四个基因四个靶点。
基于多位点同时 crispr cas9 载体及其构建方法应用

[发明专利]一种猪骨骼肌卫星细胞高效分离和纯化的方法-CN202010940072.X在审
发明人：胡悦旻;鞠辉明 -专利权人：扬州大学
申请日： 2020-09-09 - 公布日： 2020-12-01 - 主分类号： C12N5/077 文献下载
摘要：本发明公开了一种猪骨骼肌卫星细胞体外培养方法，包括以下步骤：将猪骨骼肌肉组织块依次用II型胶原酶溶液和胰蛋白酶消化后过筛，固液分离得到沉淀物；将沉淀物制成细胞悬液采用差速贴壁纯化培养，直到细胞密度达到70%及以上，用胰酶消化，用完全培养基终止消化离心，弃去上清液加入培养基重悬后进行传代培养；骨骼肌卫星细胞的鉴定：对传代培养的骨骼肌卫星细胞进行PAX7和MyoD基因免疫荧光染色鉴定，显示都呈阳性表达，且与DAPI染色的的细胞核完全重叠表明分离的细胞为骨骼肌卫星细胞。本发明的猪骨骼肌卫星细胞体外培养方法操作简便、获得细胞数量多，而且细胞纯度高，为猪骨骼肌的生长发育研究提供材料。
种猪骨骼肌卫星细胞高效分离纯化方法

[发明专利]一种控制猪PFKM表达的载体及其应用-CN201911029572.1在审
发明人： 鞠辉明;许金蔓;杨跃飞 -专利权人：扬州大学
申请日： 2019-10-28 - 公布日： 2020-01-24 - 主分类号： C12N15/85 文献下载
摘要：本发明涉及一种重组载体，所述载体包括sgRNA的编码基因和Cas9蛋白编码基因，所述sgRNA的靶位点为序列1所示的DNA。本发明提供一种用于控制猪PFKM表达的载体，通过所述载体能够控制猪细胞中的PFKM表达量，进而控制猪的肌肉的纤维组成，调节瘦肉率的变化。
蛋白编码基因编码基因纤维组成重组载体靶位点表达量瘦肉率猪细胞肌肉

[发明专利]抑制小鼠MSTN表达的方法及相应MSTN shRNA片段-CN201410693061.0在审
发明人： 鞠辉明;杨跃飞 -专利权人： 鞠辉明
申请日： 2014-11-27 - 公布日： 2015-03-11 - 主分类号： C12N15/63 文献下载
摘要：本发明提供一种抑制小鼠MSTN表达的载体及相应MSTN shRNA片段，包括分别与MSTN mRNA序列特异性结合在158位点的MSTN-mus-158、300位点的MSTN-mus-300、714位点的MSTN-mus-714和1022位点的MSTN-mus-1022。本发明设计的4条MSTN shRNA序列均有很好的抑制MSTN基因表达的活性，且4个MSTN shRNA过表达载体均具有很高的表达效率。
抑制小鼠 mstn 表达方法相应 shrna 片段

[发明专利]一种表达猪microRNA-378的方法及专用DNA片段-CN201310022086.3无效
发明人： 鞠辉明;杨跃飞;白立景;姜星 -专利权人：扬州大学
申请日： 2013-01-21 - 公布日： 2013-04-17 - 主分类号： C12N15/113 文献下载
摘要：本发明公开了一种生产猪microRNA-378的方法及其专用DNA片段。该DNA片段如SEQIDNO.1所示。含有上述DNA片段的重组载体pSingle-tTS-microRNA-378也属于本发明的保护范围之内。具体地，上述重组载体是将pSingle-tTS载体的多克隆位点插入有SEQ ID NO.1所示片段上述的猪microRNA-378前体DNA片段插入pSingle-tTS的XhoΙ位点构成的重组表达载体。将重组载体转化到细胞系中，用强力霉素诱导表达生产猪microRNA-378；和正常组细胞内microRNA-378表达相比，经诱导底物诱导后microRNA-378表达效率显著提高，各组间相差极显著（p＜0.01）。
一种表达 microrna 378 方法专用 dna 片段

[发明专利]一种肌肉特异表达猪IGF1基因的过表达载体-CN201210383179.4无效
发明人：李奎;宋成义;吴晗;鞠辉明;白立景 -专利权人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所;扬州大学
申请日： 2012-10-10 - 公布日： 2013-03-20 - 主分类号： C12N15/11 文献下载
摘要：本发明为一种猪骨骼肌中特异过表达猪内源IGF1(C1：Ea)基因的安全型表达载体。该载体包含猪内源性序列sk-α-actinPromoter/IGF1(C1:Ea)/sk-α-actin3’UTR/SV40增强子串联组成的表达盒。本发明的表达载体在细胞水平上验证了骨骼肌特异sk-α-actin启动子在成肌细胞中能高效表达，在具有成肌分化潜能的PEF细胞中仅低水平表达而在其他类型细胞中不表达。本发明中构建的载体制备转基因小鼠，通过定量PCR和WesternBlot检测出转基因小鼠骨骼肌中IGF1基因的mRNA和蛋白表达水平分别为野生型小鼠的15倍和3.5倍，并且仅在骨骼肌中高效表达。
一种肌肉特异表达 igf1 基因载体

[发明专利]一种鉴定转基因动物中目标基因拷贝数的方法-CN201010102428.9无效
发明人：李奎;鞠辉明;白立景;崔文涛;牟玉莲;唐中林;杨述林;程文科;王志伟 -专利权人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
申请日： 2010-01-27 - 公布日： 2010-11-24 - 主分类号： C12Q1/68 文献下载
摘要：本发明公开了一种鉴定转基因动物中目标基因拷贝数的方法。本发明提供的方法包括如下步骤：以转基因动物的基因组DNA为模板，分别用目标基因引物和内参基因引物进行荧光定量PCR，分别得到转基因动物的目标基因和内参基因的荧光定量PCR结果；以含有不同拷贝数的目标基因的标准品为模板，分别用目标基因引物和内参基因引物进行荧光定量PCR，分别得到标准品中的目标基因和内参基因的荧光定量PCR结果；根据标准品中的目标基因和内参基因的荧光定量PCR结果，构建关于目标基因和内参基因的循环次数的差值与目标基因拷贝数的自然对数的标准曲线，然后确定转基因动物中的目标基因的拷贝数。该方法简单易行、用传统的Southern blot方法的结果一致，说明准确可靠。
一种鉴定转基因动物目标基因拷贝方法

[发明专利]一种制备同时表达多个基因的转基因动物的方法-CN201010034318.3有效
发明人：李奎;鞠辉明;樊俊华;白立景;牟玉莲;杨述林;唐中林;崔文涛 -专利权人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
申请日： 2010-01-15 - 公布日： 2010-10-06 - 主分类号： C12N15/85 文献下载
摘要：本发明公开了一种制备同时表达多个基因的转基因动物的方法。本发明还公开了一种制备转基因胚胎的方法，上述制备转基因胚胎的方法，是将植酸酶基因和人粘病毒抗性基因A均导入目的胚胎中，得到转基因胚胎。将转基因胚胎移植到雌性的目的动物的体内，即可得到表达多个基因的转基因动物。本发明的显著优势表现在一次转基因实现多基因的同时表达，为制备转联合基因动物等提供一种便捷的手段。
一种制备同时表达基因转基因动物方法

[发明专利]一种生产猪生长激素的方法及其专用DNA片段-CN201010033947.4有效
发明人： 鞠辉明;白立景;李奎;崔文涛;牟玉莲;杨述林;唐中林 -专利权人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
申请日： 2010-01-07 - 公布日： 2010-08-04 - 主分类号： C12N15/18 文献下载
摘要：本发明公开了一种生产猪生长激素的方法及其专用DNA片段。该DNA片段，是如下1)或2)：1)其核苷酸序列如序列表中序列3的自5’端6-1108位所示；2)其核苷酸序列如序列表中序列3所示。含有上述DNA片段的重组载体也属于本发明的保护范围之内。具体地，上述重组载体是将上述的DNA片段插入pcDNA3.1(+)的多克隆位点构成的重组表达载体。含有上述DNA片段的转基因细胞系也属于本发明的保护范围之内。上述转基因细胞培养后，pcDNA-GH12组GH表达量是转pcDNA质粒对照组的16410倍；pcDNA-GH12组的GH与内参beta-actin比值为0.278，显著高于正常对照组(转pcDNA空载体组)的0.016。说明含有第1，2内含子的情况下，GH的表达量更高。
一种生产生长激素方法及其专用 dna 片段

[发明专利]一种培育转基因动物的方法-CN201010034202.X无效
发明人： 鞠辉明;白立景;李奎;牟玉莲;唐中林;杨述林;崔文涛 -专利权人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
申请日： 2010-01-13 - 公布日： 2010-07-14 - 主分类号： C12N5/10 文献下载
摘要：本发明的目的在于提供一种培育转基因动物的方法。本发明还提供一种培育转基因胚胎的方法，该培育转基因胚胎的方法，是将植酸酶基因导入目的胚胎中，得到转基因胚胎。将上述的转基因胚胎移植到假孕雌性动物的体内，得到转基因动物。本发明的转基因胚胎能表达appA基因，本发明培育的转基因动物能表达植酸酶的活性，具有可以水解植酸及其盐，释放出动物可利用的磷，使提高磷的利用率，降低粪磷含量。
一种培育转基因动物方法

[发明专利]一种表达双基因的真核表达载体-CN200910089428.7有效
发明人：李奎;鞠辉明;白立景 -专利权人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
申请日： 2009-07-17 - 公布日： 2009-12-23 - 主分类号： C12N15/85 文献下载
摘要：本发明公开了一种表达双基因的真核表达载体。该载体，其序列其序列含有植酸酶基因表达盒和人粘病毒抗性基因1表达盒。本发明的表达载体在细胞水平上验证了含双基因的表达载体的表达效率几乎和两单基因组表达效率相当。本发明的含双基因的AMP质粒转染猪PK15细胞及制备转基因小鼠，通过定量PCR检测出AMP的表达双基因(植酸酶基因(appA)和人粘病毒抗性基因1(Mx1))的效率几乎和两单基因组表达效率相当。
一种表达基因载体

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