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[发明专利]一种同时测定酒花中α-酸、β-酸和异α-酸的方法-CN201210197306.1无效
发明人：刘春凤;周芸芸;李崎;王金晶;李永仙;郑飞云 -专利权人：江南大学
申请日： 2012-06-15 - 公布日： 2012-10-10 - 主分类号： G01N30/06 文献下载
摘要：本发明公开了一种用反相高效液相色谱同时检测酒花中α-酸、β-酸和异α-酸的方法，实现3种α-酸、3种β-酸和3种异α-酸9种物质的同时快速有效地分离。其特征在于：色谱条件为色谱柱:EC 250/4Nuclesoil 100-5C18，流动相A：水溶液（磷酸0.1%，0.2mM EDTANa2）；流动相B：乙腈。流速为1.0mL/min，双波长检测UV270nm和UV315nm，柱温30℃，进样体积为10μL。该发明在酒花异构颗粒和异构浸膏的生产过程，监测酒花中α-酸、β-酸和异α-酸的变化关系，为生产工艺提供理论参考。同时该检测方法也可用于麦汁煮沸过程酒花的α-酸与异α-酸的动力学变化的研究。方法的稳定性和重现性好，操作简单、准确可靠。
一种同时测定酒花方法

[发明专利]一种测定酵母蛋白酶A活性的方法-CN201210033212.0无效
发明人：李崎;刘春凤;宋群;李永仙;郑飞云;王金晶;顾国贤 -专利权人：江南大学
申请日： 2012-02-15 - 公布日： 2012-07-18 - 主分类号： G01N21/64 文献下载
摘要：一种测定酵母蛋白酶A活性的方法，属于发酵工程领域。本发明利用共振光散射技术建立起一种测定酵母蛋白酶A活性的新方法。根据三氯乙酸可以与微量蛋白质缔合形成缔合微粒，并且此微粒的浓度在一定条件下与共振散射光强度呈正比关系的原理，用三氯乙酸缔合酵母蛋白酶A与底物酪蛋白反应前后溶液中的蛋白质，用荧光分光光度计测定其光强，根据酪蛋白的降解量得到酵母蛋白酶A活性。此方法具有检测限低、灵敏度好、稳定性高、线性范围宽、受干扰物影响小，并且快速简便、检测成本低，可以满足测定发酵液和啤酒中微量蛋白酶A活性的要求，具有较大潜力，为酵母蛋白酶A的深入研究提供可靠基础。
一种测定酵母蛋白酶活性方法

[发明专利]一种体外进化β-葡聚糖酶的方法-CN200910264847.X无效
发明人：李崎;李永仙;郑飞云;刘春凤;顾国贤;秦久福 -专利权人：江南大学
申请日： 2009-12-24 - 公布日： 2011-04-20 - 主分类号： C12N15/56 文献下载
摘要：定向进化技术是由美国工程院院士、加州理工学院化工系教授FrancesH.Arnold于90年代初期开发出来的一项蛋白质工程技术。它是基因工程、蛋白质结构和计算机技术互补发展和渗透的结果，标志着人类可以按照自己的意愿和需要改造蛋白质(酶)，甚至设计出自然界中原本不存在的全新蛋白质(酶)。作为可以工业化生产和应用的β-葡聚糖酶，对酶特性的要求是产酶水平高、耐热性好、pH稳定、培养条件简单等，其中耐热性和产酶水平是酶工业化生产和应用的主要问题。本发明基于易错PCR随机突变技术，对β-葡聚糖酶进行了热稳定性定向进化。利用建立的基于96微孔板的高通量筛选模型筛选热稳定性提高的突变株。经过三轮定向进化，共筛选得到三株热稳定性明显提高突变体2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03.突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的T50值分别比野生酶53℃提高2.2℃、5.5℃和3.5℃，达到55.2℃、58.5℃和56.5℃。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03在60℃下的半衰期t1/2，60℃(min)分别比野生酶18提高4、13和17，达到22、31和35。
一种体外进化聚糖方法

[发明专利]一种高通量筛选β-葡聚糖酶热稳定性提高突变体的方法-CN200910264848.4无效
发明人：李崎;李永仙;郑飞云;刘春凤;顾国贤;秦久福 -专利权人：江南大学
申请日： 2009-12-24 - 公布日： 2011-04-13 - 主分类号： C12Q1/34 文献下载
摘要：高通量筛选是一种同时分析多个样本的方式，从大量样本中挑选出符合目标的个体，目前广泛应用于药物开发、酶的发现和改造方面。体外定向进化作为后基因组时代一个重要的技术平台正得到日益广泛的应用。定向进化技术在改造酶的热稳定性方面已表现出一定的优越性，而将这一技术应用在β-葡聚糖酶热稳定性定向进化上国内外尚未有相关报道。采用定向进化技术对β-葡聚糖酶的热稳定性改造过程中，如何快速有效地筛选得到目标突变体是其瓶颈问题之一。本发明建立了基于酶标仪、96微孔板和环境压力的热稳定性提高突变体高通量筛选模型，见附图1。该发明将96微孔板菌落的诱导表达与菌落的原位复制技术有机结合起来，以β-葡聚糖酶与蓝色葡聚糖底物作用后释放蓝色基团特性为基础，以各孔酶反应液的吸光值大小为指标建立了直观、快速简易的高通量筛选方法。通过该方法可以筛选到热稳定性和催化活性同时提高的变异体且稳定性良好。对该方法的筛选稳定性考察结果显示，其精密度良好，RSD为8.1％，重现性达到100％，假阳性率及假阴性较低，分别为6.25％及2.1％。
一种通量筛选聚糖热稳定性提高突变体方法

[发明专利]一种高纯度耐热β-葡聚糖酶的制备方法-CN200910264846.5无效
发明人：李崎;李永仙;郑飞云;刘春凤;顾国贤;秦久福 -专利权人：江南大学
申请日： 2009-12-24 - 公布日： 2010-12-22 - 主分类号： C12N9/24 文献下载
摘要：本发明以本研究室构建的高产耐热性重组Pichia pastoris GS115-pPICZαA-bgl为出发菌，对其发酵液进行提取并分离纯化得到电泳纯β-1，3-1，4-葡聚糖酶样品。主要研究冻融法、酶法和超声破碎法破壁对酶活力的影响，考察硫酸铵分级沉淀和乙醇分级沉淀的特点，最后采用离子交换层析获得了较纯的重组酶，并用SDS-PAGE进行鉴定。重组β-葡聚糖酶粗酶液经过硫酸铵分级沉淀和DEAE-650M离子交换层析，纯化倍数为22.57倍，回收率为20.06％，最终比活力达到17674U/mg。SDS-PAGE鉴定表明纯化后的重组β-葡聚糖酶为一单一条带，分子量大小约为27kDa。
一种纯度耐热聚糖制备方法

[发明专利]一株高产耐温性β-葡聚糖酶毕赤酵母及其构建-CN200910264850.1无效
发明人：李崎;李永仙;郑飞云;刘春凤;顾国贤;秦久福 -专利权人：江南大学
申请日： 2009-12-24 - 公布日： 2010-12-01 - 主分类号： C12N15/56 文献下载
摘要：本发明公开了基因工程领域中的一种巴斯德毕赤酵母重组菌及其应用。本研究室通过体外分子进化技术，对淀粉液化芽孢杆菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因进行了热稳定性提高定向进化，获得多株热稳定性提高突变体。本发明首次在巴斯德毕赤酵母系统中表达了其中一株热稳定提高最明显β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因bgl。将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA上，构建到AOX I甲醇诱导型启动子下游，得到重组质粒pPICZαA-his6-bgl，将其经Pme I线性化后转化毕赤酵母GS115，bgl基因通过同源重组被整合到毕赤酵母染色体上，并处于酵母α因子的下游，实现了异源分泌表达。通过重组菌株培养条件的优化，β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最佳表达条件为：pH7.0，OD600为2.5，甲醇的日诱导添加量为1％，甲醇诱导后菌体的培养时间为2.5-3天。在此条件下β-葡聚糖酶分泌到培养基中的蛋白表达量为190mg/L，比酶活达到4312U/mg蛋白。SDS-PAGE结果显示表达蛋白的大小为27KDa左右，与理论分子量大小吻合。
高产耐温聚糖酶毕赤酵母及其构建

[发明专利]一种基于核磁共振原理评价啤酒口感醇厚性的方法-CN200910264849.9无效
发明人：李崎;郑飞云;李永仙;刘春凤;顾国贤;李鹏飞;姜甜 -专利权人：江南大学
申请日： 2009-12-24 - 公布日： 2010-07-07 - 主分类号： G01N24/08 文献下载
摘要：一种基于核磁共振原理(NMR)评价啤酒口感醇厚性的方法，属于啤酒质量评价领域。本发明依赖于建立的可用于啤酒中羟基质子化学位移的核磁共振检测方法，从啤酒中氢键缔合强度的角度，提出与啤酒醇厚性优劣相关的氢键化学位移指标。不同啤酒样品的羟基质子化学位移与醇厚性品评间的相关系数R2为0.6280，表明啤酒样品的羟基质子化学位移与口感醇厚性品评结果之间的拟和度较好，最终以啤酒中羟基质子化学位移与口感评价间的对应关系为纽带，确定啤酒口感评价指标羟基质子化学位移与啤酒口感的具体对应关系：正向线性关系，即口感品评中醇厚性较好的样品，羟基质子化学位移相对较大；口感品评中醇厚性较差的样品，羟基质子化学位移相对较小。该方法可用于客观有效地对不同的成品啤酒样品进行比较，从而在某种程度上弥补口感品评存在的缺陷和不足。
一种基于核磁共振原理评价啤酒口感醇厚方法

[发明专利]一种用高效液相法评价啤酒老化程度的方法-CN200810122421.6无效
发明人：李崎;郑飞云;李永仙;刘春凤;顾国贤;宗明平 -专利权人：江南大学
申请日： 2008-05-28 - 公布日： 2008-11-12 - 主分类号： G01N30/88 文献下载
摘要：一种用高效液相法评价啤酒老化程度的方法，属于啤酒质量评价领域。本发明依赖建立的可用于分离定量啤酒中各异α－酸的高效液相(HPLC)方法，提出与老化相关的T/C值指标，不同类型啤酒的T/C值与口感品评间相关系数R²均在0.72～0.92范围内，表明T/C值能够克服生产批次甚至品牌的差异来反映啤酒的老化程度，最终以T/C值与感官评价间的对应关系为纽带，确定老化指标T/C值与啤酒老化程度的具体对应关系：当T/C值＞33.4，认为啤酒处于新鲜状态，当T/C值在26.1～33.4范围，认为啤酒处于中度老化状态，当T/C值＜26.1，认为啤酒处于高度老化状态。该方法可用于客观有效的对不同质量和老化情况的成品啤酒进行评价，从而在某种程度上避免口感品评存在的缺陷。
一种高效液相法评价啤酒老化程度方法

[发明专利]一种啤酒老化的评价方法-CN200810024136.0无效
发明人：李崎;郑飞云;李永仙;刘春凤;顾国贤;刘景 -专利权人：江南大学
申请日： 2008-05-16 - 公布日： 2008-10-15 - 主分类号： G01N21/25 文献下载
摘要：一种啤酒老化的评价方法，属于啤酒质量评价领域。本发明方法为一种使用综合评价指标来评价啤酒风味老化的方法，从自由基反应和老化物质角度，涵盖啤酒老化过程中起推动作用的氧化和起抵抗作用的抗氧化两个不同方面，提出综合老化评价指标——啤酒老化稳定性系数Stability Index(SI系数)。啤酒老化稳定性系数评价指标能较好反映不同品牌、不同老化程度啤酒的老化情况，并在此基础上建立啤酒的老化综合评价体系。
一种啤酒老化评价方法

[发明专利]一株高产β－葡聚糖酶的重组大肠杆菌及其构建-CN200810108039.X无效
发明人：李崎;李永仙;郑飞云;刘春凤;顾国贤;谢焱 -专利权人：江南大学
申请日： 2008-05-13 - 公布日： 2008-10-15 - 主分类号： C12N15/56 文献下载
摘要：一株高产β－葡聚糖酶的重组大肠杆菌及其构建，属于基因工程领域。从高产β－葡聚糖酶的淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens SYB－001专利菌株(ZL.200510038488.8)中扩增出β－1，3－1，4－葡聚糖酶基因的开放阅读框序列SEQ ID NO：1，将其插入到大肠杆菌表达载体pET28a(+)中，得到重组载体pET28a(+)－bgl，转化Escherichia coli BL21(DE3)得到重组菌E.coli BL21(DE3)－pET28a(+)－bgl，CGMCC No.2470。重组菌CGMCC No.2470经异丙基硫代－β－D－半乳糖苷(IPTG)诱导，该基因得到了高效表达，在LB培养基中总酶活可达322.0U/mL，胞外酶活为127.5U/mL，最适反应温度为50℃，最适pH为6.0。该菌株适合在工业化β－葡聚糖酶生产中推广和应用。
高产聚糖重组大肠杆菌及其构建

[发明专利]一株产较高热稳定性重组β－葡聚糖酶的基因工程菌及其构建-CN200810108041.7无效
发明人：李崎;李永仙;郑飞云;刘春凤;顾国贤 -专利权人：江南大学
申请日： 2008-05-13 - 公布日： 2008-10-08 - 主分类号： C12N1/21 文献下载
摘要：一株产较高热稳定性重组β－葡聚糖酶的基因工程菌及其构建，属于基因工程技术领域。本发明采用易错PCR技术扩增高产β－葡聚糖酶的淀粉液化芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SYB－001(ZL.200510038488.8)专利菌株β－1，3－1，4－葡聚糖酶基因的开放阅读框序列，向其中随机引入突变，将改造后的基因插入到大肠杆菌表达载体pET28a(+)中，转化Escherichia coli BL21(DE3)，构建重组子文库，经筛选，最终得到一株可以产较高热稳定性重组酶的突变株大肠埃希氏菌(E.coli BL21(DE3)－pET28a(+)－bglt 1)CGMCC No.2741。经酶学性质分析，CGMCC No.2741最适温度为 55℃，在50－55℃下较稳定，各比出发菌SYB－001提高5℃。
一株产较高热稳定性重组聚糖基因工程及其构建

[发明专利]一种重组大肠杆菌高效表达β－葡聚糖酶的方法-CN200810108040.2无效
发明人：李崎;李永仙;郑飞云;刘春凤;顾国贤 -专利权人：江南大学
申请日： 2008-05-13 - 公布日： 2008-10-08 - 主分类号： C12N9/42 文献下载
摘要：一种重组大肠杆菌高效表达β－葡聚糖酶的方法，属于发酵工程领域。本发明采用异丙基硫代－β－D－半乳糖苷(IPTG)和乳糖联合诱导，大幅提高了重组大肠杆菌(E.coli BL21(DE3)－pET28a(+)－bgl)CGMCC No.2470表达β－葡聚糖酶的水平和胞外酶占总酶活的比例，在初始发酵培养基(TB培养基)中，总酶活可达1883.3U/mL，其中胞外酶活可达1024.3U/mL，占总酶活的54.4％。本发明可应用于相关工业生产。
一种重组大肠杆菌高效表达聚糖方法

[发明专利]一株适合纯生啤酒酿造的蛋白酶A缺陷型酵母及使用方法-CN200610155976.1无效
发明人：李崎;郑飞云;郝俊光;李永仙;顾国贤;蒋凯 -专利权人：江南大学
申请日： 2006-12-27 - 公布日： 2007-07-11 - 主分类号： C12N1/19 文献下载
摘要：一株适合纯生啤酒酿造的蛋白酶A缺陷型酵母及使用方法，属于生物工程技术领域。本发明菌株为下面发酵酿酒酵母(Saccharomyces Carlsbergensis)QD06－2，保藏编号为CGMCC No1858。该菌为二倍体工业菌株的蛋白酶A缺陷型改造株，不含任何外源基因，在啤酒酿造过程中不分泌蛋白酶A，发酵性能正常，酿造的配套关键控制技术参数为：11°P麦汁，α－氨基氮不低于200mg/100mL，充氧达12mg/L，麦汁接种量为酵母细胞浓度1.8×10⁶～2.1×10⁶个/mL，建议回用代数不超过8代，其它技术参数同普通菌株纯生啤酒酿造过程。由此，可获得与熟啤酒泡沫稳定性一致的纯生啤酒，解决了现有纯生啤酒泡沫稳定性差的行业难题，适合在纯生啤酒生产中推广和应用。
适合生啤酒酿造蛋白酶缺陷酵母使用方法

[发明专利]一种改善高蛋白质含量啤酒大麦所制麦芽品质的方法-CN200610037951.1无效
发明人：李崎;李永仙;郑飞云;顾国贤;林先军 -专利权人：江南大学
申请日： 2006-01-19 - 公布日： 2006-10-04 - 主分类号： C12C1/00 文献下载
摘要：一种改善高蛋白质含量啤酒大麦所制麦芽品质的方法，属于啤酒制造技术领域。本发明在麦芽制造过程中采用接种微生物的措施，利用微生物分泌的酶系，协助高蛋白质含量啤酒大麦的溶解，使得原本不能正常制麦的啤酒大麦达到较好的制麦效果，改善了制得的大麦麦芽的品质，麦芽中的蛋白质溶解适当、胚乳溶解均匀、有效解决了成品麦芽的葡聚糖含量高、麦芽汁过滤慢、粘度大等缺点。利用本发明制得的微生物麦芽进行协定糖化试验，显示微生物麦芽和普通麦芽相比，多项酿造特征指标得到明显改善，其品质均满足QB1686－93的一级标准要求，可以满足国内啤酒生产企业生产的需要，并可以代替进口大麦和进口麦芽。
一种改善蛋白质含量啤酒大麦麦芽品质方法

[发明专利]一种低热量啤酒的生产工艺-CN200510094669.2无效
发明人：李崎;孙志广;郑飞云;李峰;顾国贤;逮伟防;李永仙;刘群涛 -专利权人：江南大学;河南奥克啤酒实业有限公司
申请日： 2005-09-30 - 公布日： 2006-03-08 - 主分类号： C12C12/02 文献下载
摘要：一种低热量啤酒的生产工艺，属于啤酒生产技术领域。本发明采用调节酿造工艺，稀释和添加膳食纤维来制备低热量啤酒。主要包括啤酒原料的糊化、糖化、煮沸、添加酒花等工艺过程，得到高度发酵的含糖量低的嫩啤酒，经后稀释并添加膳食纤维及其它低热量的浸出物，制得低热量啤酒。本发明的低热量啤酒其热量低于800kJ/L，比普通啤酒的热量(1600kJ/L)降低了一半以上，既具有普通啤酒的风味，口感柔和，且具有一定的保健功能。
一种低热量啤酒生产工艺