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[发明专利]基于CRISPR-Cas9系统和PB转座子系统的羊早期胚胎发育的谱系示踪方法-CN202211612527.0在审
发明人：于坤;邓守龙;许雪玲;李岩;连正兴 -专利权人：中国农业大学
申请日： 2022-12-14 - 公布日： 2023-05-12 - 主分类号： C12N15/85 文献下载
摘要：本发明公开了基于CRISPR‑Cas9系统和PB转座子系统的羊早期胚胎发育的谱系示踪方法，具体是CRISPR‑Cas9介导的羊Rosa26基因敲除和定点插入Cas9‑T2A‑EGFP基因的方法，用来对合成靶DNA进行编辑。本发明还提供由合成靶DNA介导的谱系示踪载体。该载体包含40种整合条码和合成靶DNA及相应的三个独立转录sgRNA。该合成靶DNA嵌入在表达红色荧光蛋白tdTomato的PB转座子载体上。此系统能够产生大量的可遗传修复结果，并可通过整合条形码对这些序列进行区分。该谱系示踪载体体系可直接转染目标细胞，随着发育对目标细胞进行追踪，提供反刍动物发育的综合分子细胞图谱，应用前景广阔。
基于 crispr cas9 系统 pb 座子早期胚胎发育谱系方法

[发明专利]一种Dox调控的记录猪组织分化与器官发生的谱系示踪技术-CN202210693445.7有效
发明人：于坤;邓守龙;许雪玲;杜旭光;李攀;卢天宇 -专利权人：中国农业大学
申请日： 2022-06-17 - 公布日： 2023-01-13 - 主分类号： C12N15/113 文献下载
摘要：本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种将40种整合条形码片段与强力霉素(Doxycycline，Dox)调控CRISPR/Cas9编辑产生的indels相结合用于研究哺乳动物细胞在发育、再生和器官形成过程的谱系示踪研究方法。
一种 dox 调控记录组织分化器官发生谱系技术

[发明专利]一种精液冷冻保存稀释液及其应用-CN202211049637.0有效
发明人：房义;杨其恩;贾功雪;钟荣珍;邓守龙 -专利权人：中国科学院东北地理与农业生态研究所
申请日： 2022-08-30 - 公布日： 2022-12-16 - 主分类号： A01N1/02 文献下载
摘要：本发明提供了一种精液冷冻保存稀释液及其应用，包括野菊花提取物与贯叶金丝桃提取物。与现有技术相比，本发明在精液冷冻保存稀释液中添加野菊花和贯叶金丝桃提取物，有效降低了精子质膜不饱和脂肪酸冷冻损伤，显著提高冻融精子活力、运动、顶体完整性和受精能力，明显改善精子冷冻保存效果，适用于绵羊精液超低温长期保存和人工授精，效果可靠、易于推广、操作简单，对精子无副作用。
一种精液冷冻保存稀释液及其应用

[发明专利]一种提高CRISPR/Cas9介导的双等位基因突变效率的方法及其应用-CN201910277213.1有效
发明人：连正兴;李岩;邓守龙;刘国世;连玲 -专利权人：中国农业大学
申请日： 2019-04-08 - 公布日： 2022-05-24 - 主分类号： C12N15/90 文献下载
摘要：本发明涉及基因工程和分子遗传育种技术领域，具体涉及一种提高CRISPR/Cas9介导的双等位基因突变效率的方法及其应用。本发明提供的CRISPR/Cas9基因编辑方法包括向原核期胚胎中导入基因编辑核酸的步骤，所述基因编辑核酸包括Cas9 mRNA和sgRNA；所述基因编辑核酸中，所述Cas9 mRNA和sgRNA的摩尔浓度比例为1：10～1：20。本发明提供的基因编辑方法，显著提高了双等位基因突变的效率，进而有效降低了基因编辑嵌合个体的比例，提高了双等位基因突变个体的比例，对于目标性状动物的构建和遗传育种具有重要的应用价值。
一种提高 crispr cas9 等位基因突变效率方法及其应用

[发明专利]一种在Rosa26位点定点敲入人源补体调节蛋白小型猪的制备方法-CN202210168461.4有效
发明人：秦川;卢天宇;邓守龙;杨博超;于佳楠;王若琳;徐亚新 -专利权人：中国医学科学院医学实验动物研究所
申请日： 2022-02-24 - 公布日： 2022-05-06 - 主分类号： C12N15/113 文献下载
摘要：本发明公开了一种在Rosa26位点定点敲入人源补体调节蛋白小型猪的制备方法，本发明通过定点基因重组的方式，将人源补体调节蛋白基因插入到猪ROSA26基因位点，从而构建得到组成型表达人补体调节蛋白的小型猪，构建得到的小型猪不仅避免了外源随机插入造成的遗传背景不清晰和后代繁育过程中因为染色体的分离而造成的表达量不稳定，而且为今后异种移植和免疫相关疾病的研究提供了重要动物资源，具有重要的临床应用价值。
一种 rosa26 定点敲入人源补体调节蛋白小型制备方法

[发明专利]一种提高CRISPR/Cas9介导的同源修复效率的方法-CN201910277216.5有效
发明人：连正兴;李岩;邓守龙;刘国世;连玲 -专利权人：中国农业大学
申请日： 2019-04-08 - 公布日： 2022-04-12 - 主分类号： C12N5/10 文献下载
摘要：本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种提高CRISPR/Cas9介导的同源修复效率的方法。本发明提供一种转染后培养基因编辑细胞的细胞培养液，所述培养液包含基础培养液和p53蛋白小分子激动剂；所述p53蛋白小分子激动剂包括RITA、CTX1、Nutlin‑3中的一种或多种。本发明还提供利用所述培养液提高基因编辑的同源修复效率的方法。通过在转染后培养基因编辑细胞的细胞培养液中添加p53蛋白的小分子激动剂，极大地提高了基因编辑过程的同源修复效率，进而提高了基因编辑效率，有效降低了阳性细胞的筛选工作量，同时具有操作简便、成本低等优势，应用前景广阔。
一种提高 crispr cas9 同源修复效率方法

[发明专利]一种肌肉生长抑制素MSTN的突变体及其应用-CN201910277191.9有效
发明人：连正兴;李岩;邓守龙;刘国世;连玲 -专利权人：中国农业大学
申请日： 2019-04-08 - 公布日： 2022-03-08 - 主分类号： C07K14/475 文献下载
摘要：本发明涉及基因工程及遗传育种技术领域，具体涉及一种肌肉生长抑制素MSTN的突变体及其应用。本发明提供的MSTN蛋白突变体，具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。所述突变体能够明显促进动物的骨骼肌的生长发育，携带本发明所述的MSTN突变体的动物的肌纤维密度显著提高，动物表现明显的双肌臀性状，产肉量也可随之增加。本发明提供的MSTN蛋白突变体及其编码基因可在实践中用于制备双肌臀表型动物模型或用于双臀肌性状动物的遗传育种。
一种肌肉生长抑制 mstn 突变体及其应用

[发明专利]利用乳腺生物反应器提高乳汁中褪黑素含量的方法-CN201710113626.7有效
发明人：刘国世;连正兴;马腾;何长久;张效生;邓守龙;宋玉坤;张金龙;姬鹏云;富俊才;韩红兵;田秀芝;陶景丽;李岩 -专利权人：中国农业大学
申请日： 2017-02-28 - 公布日： 2021-02-26 - 主分类号： C12N15/90 文献下载
摘要：本发明提供一种利用乳腺生物反应器提高乳汁中褪黑素含量的方法，其是将褪黑素关键合成酶AANAT和HIOMT基因的cDNA序列连接酪蛋白启动子，通过高效的CRISPR/Cas9系统，整合到羊的染色体基因中，通过乳腺反应器表达酶AANAT和HIOMT，从而在乳腺中合成天然褪黑素。转基因羊乳腺反应器具有较高的重组褪黑素合成酶表达水平，并且能够提高乳汁中褪黑素含量。
利用乳腺生物反应器提高乳汁中褪黑素含量方法

[实用新型]一种新型的基因显微注射针-CN201721530104.9有效
发明人：于坤;邓守龙;连正兴;李岩 -专利权人：中国农业大学
申请日： 2017-11-15 - 公布日： 2018-08-31 - 主分类号： C12M1/00 文献下载
摘要：本实用新型属于转基因技术领域，尤其涉及一种新型的基因显微注射针。所述注射针的外形和内部空间均呈圆锥状，所述注射针的尖端内径为0.5μm，所述注射针在距所述尖端30μm处的内径为10μm，所述注射针在距所述尖端50μm处的内径为20μm，所述注射针在距所述尖端45μm处的容积为3pL。该注射针结构简单，对高度、内径、容积等进行了合理设置，由此在进行显微操作时，可根据显微注射针上刻度的位置吸取相应量的外源基因进行注射，能精确控制注射剂量，可达到注射剂量pL级精度。依据注射针上标记的刻度吸入外源基因，保证了pL级精度不受基因液粘度的影响，避免了人为因素引入的注射剂量不一而导致注射后胚胎发育不一致。
注射针显微注射针注射剂量外源基因基因注射本实用新型注射针结构转基因技术合理设置胚胎发育人为因素显微操作不一致液粘度圆锥状吸入引入保证

[发明专利]在CRISPR/CAS9基因编辑中提高同源修复效率的方法-CN201810191682.7在审
发明人：李岩;于坤;连正兴;邓守龙;连玲 -专利权人：中国农业大学
申请日： 2018-03-08 - 公布日： 2018-08-24 - 主分类号： C12N15/90 文献下载
摘要：本发明提供一种在CRISPR/CAS9基因编辑中提高同源修复效率的新方法，其是利用CRISPR/CAS9系统进行基因编辑，通过将MTR值控制在1×105‑5×105的范围内，来提高同源修复效率。其中，所述MTR值为待敲入的外源基因DNA的摩尔数与待打靶基因摩尔数的比值。本发明依据细胞自身的同源修复机制和细胞周期特点，在基因编辑过程中通过增加修复模板DNA的用量，为基因准确修复提供丰富的模板，进而减少非同源末端连接的比例，使得修复的平衡更倾向于同源修复。本方法可使体外培养体细胞的基因修复效率提升到90％以上，比国际现行方法高出30％，具有广阔的应用前景。
同源基因修复修复效率摩尔数非同源末端连接基因修复体外培养外源基因细胞周期效率提升模板DNA 体细胞细胞平衡应用

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