本发明公开了一种检测黄盖鲽鱼卵黄原蛋白的免疫印迹检测试剂盒及其应用。该试剂盒含有黄盖鲽鱼卵黄原蛋白代谢产物卵黄脂磷蛋白纯品及其单克隆抗体,制备时,首先利用凝胶过滤和离子交换两步层析法从黄盖鲽鱼卵匀浆提取液中纯化出卵黄脂磷蛋白,然后通过杂交瘤细胞免疫制得卵黄脂磷蛋白的单克隆抗体,并利用Hitrap Protein G层析,纯化获得鼠抗黄盖鲽卵黄脂磷蛋白单克隆抗体。本发明的试剂盒可以用于海洋环境雌激素类药物的筛选,能够灵敏、方便的定性检测黄盖鲽鱼血液、体表粘液、肝脏组织及肝细胞培养液中的卵黄原蛋白,最低检测限为0.75ng/mL,为我国近岸海域内分泌干扰物的检测提供了重要依据。