[发明专利]一种通过融合底物结合功能域提升水解能力的角蛋白酶变体

说明书

本发明公开了一种通过融合底物结合功能域提升水解能力的角蛋白酶变体，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明采用PCR和Gibson连接技术在角蛋白酶KerZ1的C端通过连接肽成功融合表达来自于里氏木霉的底物结合功能域，得到角蛋白酶变体KerZ1/CBM‑L8。酶活测定结果显示角蛋白酶变体KerZ1/CBM‑L8酶活只有KerZ1的41.5％，但羽毛水解实验结果显示角蛋白酶变体KerZ1/CBM‑L8平均酶活的羽毛水解能力是KerZ1的2.71倍，更具有应用价值与潜力。

技术领域

本发明涉及一种通过融合底物结合功能域提升水解能力的角蛋白酶变体，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

角蛋白酶是一类可催化角蛋白分解的水解酶，在饲料、化妆品、制药、制革等行业都有广泛的应用。但羽毛、羊毛等都是强疏水性底物，酶与底物的结合能力在水解过程中尤为重要，因此提高角蛋白酶与底物的结合能力对提高角蛋白酶的水解能力有着重要的意义。为了提升角蛋白酶的水解能力，本发明通过融合底物结合功能域来提高角蛋白酶与底物的碰撞几率进而提高其水解能力。

虽然发明人课题组前期已经构建获得一株角蛋白酶重组菌株，该菌株在15L发酵罐上可发酵获得426.60KU/mL以上的角蛋白水解活性的角蛋白酶产品，是目前文献已报道的重组角蛋白酶表达的最高水平。但是该角蛋白酶在羽毛水解的应用实验中并未体现出显著的优势。

而在工业实际应用中，一种大大提高酶制剂在羽毛水解等角蛋白废弃物回收利用方面的应用价值的角蛋白酶，成为研究的热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过融合底物结合功能域提升水解能力的角蛋白酶变体。

本发明提供了一种通过融合底物结合功能域提升水解能力的角蛋白酶变体，所述变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的角蛋白酶与氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的底物结合功能域进行融合表达，命名为KerZ1/CBM-L8。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的角蛋白酶与氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的底物结合功能域，通过连接肽GGGGSGGGGSGGGGS进行融合表达得到的。

在本发明的一种实施方式中，编码所述底物结合功能域核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述亲本酶角蛋白酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶变体KerZ1/CBM-L8的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述角蛋白酶变体KerZ1/CBM-L8的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明还提供了编码上述角蛋白酶变体KerZ1/CBM-L8的基因。

本发明还提供了携带上述基因的重组载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组载体是以pP43NMK为表达载体。

本发明还提供了表达上述角蛋白酶变体KerZ1/CBM-L8，或携带上述基因，或携带上述重组载体的重组细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以细菌或真菌为宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisWB600。

本发明还提供了提高角蛋白酶对于蛋白的水解能力的方法，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的角蛋白酶与氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的底物结合功能域通过连接肽GGGGSGGGGSGGGGS进行融合表达。