[发明专利]维生素B12代谢相关基因的分型试剂盒、引物和分型方法

说明书

本发明涉及基因检测技术领域，具体讲，涉及一种维生素B12代谢相关基因的分型试剂盒、引物和分型方法。分型试剂盒至少包括核酸扩增试剂和单碱基延伸反应试剂；核酸扩增试剂中含有如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.60所示的PCR扩增引物；单碱基延伸反应试剂中含有如SEQ ID NO.61～SEQ ID NO.101所示的单碱基延伸引物。分型方法包括：PCR扩增引物进行PCR扩增反应、碱性磷酸酶消化、单碱基延伸引物进行单碱基延伸反应、脱盐处理、高效液相色谱‑质谱联用检测。本发明试剂盒和检测方法可提高维生素B12代谢相关基因的分型检测效率、简便易行、准确性高、自动化程度高。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体讲，涉及一种维生素B12代谢相关基因的分型试剂盒、引物和分型方法。

背景技术

维生素B12是所有人体组织必不可少的营养素，是食物释放能量的关键。自然界中的维生素B12都是微生物合成的，高等动植物不能制造维生素B12，所以人体获得的维生素B12主要来源于动物性食品，其中动物内脏、肉类、蛋类是维生素B12的丰富来源，人体对维生素B12的需要量极少，人体每天约需12μg(1/1000mg)。维生素B12主要有两方面的生理功能：一是作为甲基转移酶的辅因子，参与蛋氨酸、胸腺嘧啶等的合成，缺乏时影响婴幼儿的生长发育；二是保护叶酸在细胞内的转移和贮存，维生素B12缺乏时，人类红细胞叶酸含量低，肝脏贮存的叶酸降低。

人体对维生素B12的吸收涉及到许多基因的参与。维生素B12首先在胃中与GIF基因编码的称为胃内因子的蛋白进行结合，并形成一种“维生素B12-胃内因子复合物”，这种复合物一方面可以防止维生素B12被小肠内水解酶破坏，另一方面当复合物移行至回肠并与回肠黏膜的特殊受体结合时，能够促进回肠上皮对维生素B12的吸收，当人体缺乏胃内因子时，维生素B12的吸收过程就会出现障碍，红细胞的生成也将受到影响，恶性贫血也可能就此形成。在胃内形成的“维生素B12-胃内因子复合物”通过TCN1基因编码的TCN1转运蛋白将其转运至肠道中，与位于小肠细胞细胞膜上的“CUBAM复合物”进行结合。“CUBAM复合物”是维生素B12吸收过程中所必需，它是由CUBN和AMN基因分别编码的两种蛋白质Cubilin和Anmnionless组成。Anmnionless蛋白主要存在于小肠细胞的细胞膜上，Anmnionless蛋白与Cubilin蛋白结合，将Cubilin蛋白锚定在细胞膜上，当维生素B12通过小肠时，Cubilin蛋白与维生素B12进行结合，Anmnionless蛋白有助于将“Cubilin-维生素B12复合物”转移到肠道细胞中，随之维生素B12被释放到血液中，血液中的维生素B12通过与TCN2基因编码的一种叫做转钴胺素II的血浆球蛋白进行结合形成“TCN2-钴胺复合物”，转钴胺素II蛋白主要起到转运维生素B12的作用。CD320基因编码转钴胺受体(TCBLR)，该受体位于质膜上，能够与“TCN2-钴胺复合物”结合，并通过内吞作用将复合物内化，维生素B12由此进入细胞，参与到机体的生命活动过程中。维生素B12吸收过程涉及多种基因及其所表打的蛋白。因此，当所涉及的基因发生特定突变时，都会引起蛋白功能表达的异常，从而影响维生素B12的吸收过程。

维生素B12代谢相关基因单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)的检测不仅可以人体内维生素B12吸收水平和状态，了解食物中的维生素B12对人体吸收与代谢的影响，还可以了解各类食物中维生素B12对不同人体基因敏感的差异。

目前常用的检测SNP位点的方法有PCR-直接测序法、PCR-限制性片段长度多态性分析法(PCR-RFLP)、PCR-基因芯片法、荧光定量PCR法、高通量测序法等，这些技术在基因分型和基因突变检测中有着广泛的应用。