本发明涉及基因检测技术领域,具体讲,涉及一种维生素B12代谢相关基因的分型试剂盒、引物和分型方法。分型试剂盒至少包括核酸扩增试剂和单碱基延伸反应试剂;核酸扩增试剂中含有如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.60所示的PCR扩增引物;单碱基延伸反应试剂中含有如SEQ ID NO.61~SEQ ID NO.101所示的单碱基延伸引物。分型方法包括:PCR扩增引物进行PCR扩增反应、碱性磷酸酶消化、单碱基延伸引物进行单碱基延伸反应、脱盐处理、高效液相色谱‑质谱联用检测。本发明试剂盒和检测方法可提高维生素B12代谢相关基因的分型检测效率、简便易行、准确性高、自动化程度高。