[发明专利]月季细胞的快速悬浮培养方法和高效遗传转化方法

权利要求书

1.一种月季细胞的快速悬浮培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)愈伤组织的诱导：选取月季幼嫩叶片，将选取的月季幼嫩叶片接种到诱导培养基中，进行愈伤组织诱导培养；将诱导的愈伤组织转移至增殖培养基中，进行增殖培养；

(2)悬浮细胞的制备：选取步骤1)增殖培养1个月的愈伤组织；将选取的愈伤组织接种到无凝胶的增殖培养基中；将该培养基置于恒温震荡培养箱中进行培养，获得稳定的初代悬浮细胞；

(3)悬浮细胞的继代培养：选取步骤2)获得的初代悬浮细胞再接种于无凝胶的增殖培养基上；将该无凝胶增殖培养基置于恒温震荡培养箱中培养，进而获得继代培养的月季悬浮细胞；

(4)继代培养悬浮细胞的保存：对步骤3)获得的含有继代培养的月季悬浮细胞的无凝胶增殖培养基进行过滤，获得继代培养的月季悬浮细胞，取该细胞置于含凝胶的增殖培养基上进行继代保存。

2.根据权利要求1所述的快速悬浮培养方法，其特征在于，步骤1)所述诱导培养基成分包括4.40g·L^-1-4.45g·L^-1MS salt、2.5mg·L^-1-3.5mg·L^-12,4-D、0.05mg·L^-1KT、30g·L^-1Glucose、0.3％Gel。

3.根据权利要求1所述的快速悬浮培养方法，其特征在于，步骤1)所述增殖培养基包括4.40g·L^-1-4.45g·L^-1MS salt、0.8mg·L^-1-1.2mg·L^-12,4-D、0.8mg·L^-1-1.2mg·L^-16-BA、6％Glucose、0.3％Gel。

4.根据权利要求1所述的快速悬浮培养方法，其特征在于，步骤1)中所述愈伤组织诱导培养的条件是25℃，黑暗条件下，时间是2周；所述增殖培养的条件是25℃，黑暗条件下。

5.根据权利要求1或2所述的快速悬浮培养方法，其特征在于，步骤2)所述培养的条件是25℃，黑暗条件下，130rpm/min震荡培养，每周更换一次培养基，持续4至8周，每周清除大块愈伤。

6.一种使用权利要求1所述的月季悬浮细胞的高效遗传转化方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)载体转化农杆菌：将质粒转化到农杆菌菌株中，挑选转化成功的单菌落，接种于LB液体培养基中培养，离心去除上清液，收集阳性农杆菌；

(2)用MS重悬溶液重悬步骤1)离心收集的阳性农杆菌，从而获得侵染液；

(3)过滤并收集权利要求1中所述的月季悬浮细胞；

(4)将步骤3)获得的月季悬浮培养细胞置于步骤2)获得的侵染液中进行侵染，获得已转染的悬浮细胞；

(5)共培养：取步骤4)获得的已转染的悬浮细胞，置于共培养培养基中共培养；

(6)筛选培养：取步骤5)共培养结束的悬浮细胞，置于选择增殖培养基中进行选择培养，获得月季悬浮细胞团。

7.根据权利要求6所述的高效遗传转化方法，其特征在于，步骤2)所述MS重悬溶液包括4.40g·L^-1-4.45g·L^-1MS salt、8mM-12mM MES、8mM-12mM MgCl₂、3％Glucose、180μM-220μMAS。

8.根据权利要求6所述的高效遗传转化方法，其特征在于，步骤5)所述共培养培养基的成分包括4.40g·L^-1-4.45g·L^-1MS salt、0.8mg·L^-1-1.2mg·L^-12,4-D、0.8mg·L^-1-1.2mg·L^-16-BA、4.5％Glucose、0.3％Gel。