[发明专利]基于三坐标空间定位的组织三维空间组学方法

权利要求书

1.基于三坐标空间定位的组织三维空间组学方法，其特征在于：该方法通过多轮DNA连接反应间接或直接对组织中细胞的分析物进行三维空间编码，再通过测序得到对应组织中细胞的空间位置和生物学信息，实现组织的三维空间组学分析。

2.根据权利要求1所述的基于三坐标空间定位的组织三维空间组学方法，其特征在于，所述通过多轮DNA连接反应间接对组织细胞中的分析物进行三维空间编码具体包括以下步骤：

(1)提供L块基片，对基片的表面进行物理或化学修饰，使其产生可以与寡核苷酸5’端连接的基团；

(2)提供L种第一组定位寡核苷酸，命名为Z-DNA，其中Z-DNA的5’端修饰特定基团，与基片表面修饰基团连接；

(3)将L种Z-DNA分别连接到L块基片上，制作L块带有Z-DNA编码的基片；

(4)提供与Z-DNA的3’端杂交的夹板寡核苷酸1；

(5)提供M种第二组定位寡核苷酸，命名为X-DNA，其中X-DNA包含与夹板寡核苷酸1部分基本互补的序列，且5’端修饰磷酸基团，可与Z-DNA的3’端连接；

(6)将M种X-DNA与夹板寡核苷酸1退火杂交，沿X轴方向连接到Z-DNA的3’端，形成M行X-DNA条形码；

(7)提供与X-DNA的3’端杂交的夹板寡核苷酸2；

(8)提供N种第三组定位寡核苷酸，命名为Y-DNA，其中Y-DNA包含与夹板寡核苷酸2部分基本互补的序列，且5’端修饰磷酸基团，可与X-DNA的3’端连接；

(9)将N种Y-DNA与夹板核苷酸2退火杂交，沿Y轴方向连接到X-DNA的3’端，形成N列Y-DNA条形码，由此产生L种M*N个的三维空间编码阵列；

(10)取L片连续切割后的组织样品分别与上述方法产生的L种M*N个空间编码阵列接触；

(11)释放组织样品中的分析物，与Y-DNA上的捕获域进行特异性结合；

(12)构建测序文库，上机进行二代测序，以鉴定与捕获域特异性结合的分析物及其空间位置信息；

(13)采用对应的生物信息学算法，对获得的测序数据，根据每块基片上X-DNA编码和Y-DNA编码位置获得二维坐标(x_i，y_j)，根据不同基片上的Z-DNA编码获得坐标z_k，由此获得分析物的三维坐标(x_i，y_j，z_k)，从而确定分析物在组织样品中的空间位置，重构组织三维空间分析图谱。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于:步骤(1)中所述基片为硅片、玻片、盖玻片、氧化铟锡导电玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯片中的一种；。

4.根据权利要求2所述方法，其特征在于:步骤(1)中对基片的表面进行物理修饰或化学修饰，使其产生可以与寡核苷酸5’端连接的基团，所述物理修饰包括刻蚀、蒸镀、旋涂中的一种，所述化学修饰包括原位合成、共价偶联、分子组装、亲和作用中的一种。

5.根据权利要求2所述方法，其特征在于:步骤(1)中产生可以与寡核苷酸5’端连接的基团，所述基团包括琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、巯基、氨基、醛基、环氧、大环炔、叠氮其中的一种。

6.根据权利要求2所述方法，其特征在于:步骤(2)中所述第一组定位寡核苷酸Z-DNA5’端修饰特定基团，与基片表面修饰基团连接，所述基团包括NHS、马来酰亚胺、巯基、氨基、醛基、环氧、大环炔、叠氮其中的一种。

7.根据权利要求2所述方法，其特征在于:步骤(2)中所述L种第一组定位寡核苷酸Z-DNA包含空间条形码Z和两段恒定序列，所述两段恒定序列包括第一恒定序列和第二恒定序列，不同基片上Z-DNA的空间条形码Z不同，共有L种空间条形码Z，且第一恒定序列为PCR扩增接头，第二恒定序列与步骤(4)中所述夹板寡核苷酸1的部分序列互补。

8.根据权利要求2所述方法，其特征在于:步骤(3)中所述将L种Z-DNA分别连接到L种基片上，所述连接为共价偶联、分子组装、亲和作用中的一种。