[发明专利]一种促进心肌再生的重组人CHK1蛋白激酶水凝胶及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种含有CHK1蛋白激酶-穿膜肽融合蛋白的可注射水凝胶，其特征在于，由所述融合蛋白与成胶前体分子在水相中混匀而成，所述融合蛋白包括CHK1蛋白激酶序列和TAT穿膜肽序列，所述CHK1蛋白激酶序列和所述TAT穿膜肽序列通过连接肽连接，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述成胶前体分子为dFEFKdFEFKYRGD。

2.根据权利要求1所述含有CHK1蛋白激酶-穿膜肽融合蛋白的可注射水凝胶，其特征在于，所述融合蛋白与成胶前体分子的质量比为1：(1.9～2.1)。

3.一种根据权利要求1所述可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)称取所述成胶前体分子粉末，室温下用双蒸水充分溶解，过滤灭菌，用无菌碳酸氢钠调pH至7.3-7.5，按照成胶前体分子浓度为18-22mg/mL浓度的定容，得到A液，备用；

(2)取含有所述融合蛋白的溶液，加无菌PBS使蛋白溶液的浓度为9-11mg/mL，得到B液，备用；

(3)室温下将步骤(1)得到的A液和步骤(2)得到的B液混合，缓慢吹打混匀，得到可注射水凝胶。

4.一种CHK1蛋白激酶-穿膜肽融合蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

第一步：合成CHK1蛋白激酶-穿膜肽融合蛋白TAT-CHEK1的核苷酸序列，该核苷酸序列如SEQ NO.3所示；

第二步：构建pFastBacHTA-CHEK1昆虫细胞载体

(1)质粒设计：

pUCori，F1ori终止子:SV40poly(A)signal；酶切位点5’BamHI，3’HindIII；TAT-CHEK1引物序列：

F：CTGTATTTTCAGGGCGCCATGGATCCCATGGACTACAAGGACGACG

R：CCTCTAGTACTTCTCGACAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCC

(2)PCR扩增TAT-CHEK1片段，并进行鉴定纯化

使用PrimeSTAR HS DNA Polymerase试剂盒，体系条件如下：

引物各稀释到10nmol/ul浓度加入到反应体系中；

PCR 50ul反应体系：

PCR反应条件：

PCR出来的产物进行纯化，纯化步骤：binding buffer，12000rpm离心1分钟；Washingbuffer12000rpm，1min清洗两次；再用20-50ul的水洗脱下来；

(3)连接载体与TAT-CHKE1进行重组

MultiS One Step Cloning Kit试剂盒进行重组：

每个片段最适使用量＝[0.02×片段碱基对数]ng

例如，将长度分别为0.5kb、1kb、2kb的插入片段克隆至长度为5kb的克隆载体时，载体与各片段最适使用量为：

线性化克隆载体最适使用量：0.02×5000＝100ng；

0.5kb插入片段最适使用量：0.02×500＝10ng；

1kb插入片段最适使用量：0.02×1000＝20ng；

2kb插入片段最适使用量：0.02×2000＝40ng；

A.线性化克隆载体的使用量应在50ng-200ng之间；当使用上述公式计算DNA最适使用量超出这个范围时，直接选择最低/最高使用量即可；

B.各插入片段的使用量应大于10ng；当使用上述公式计算最适使用量低于这个值时，直接使用10ng即可；

C.线性化克隆载体和插入片段扩增产物不进行DNA纯化直接使用时，加入总体积应不超过反应体系体积的1/5，即4μl；

重组反应：

于冰上配置以下反应体系：

为了确保加样的准确性，在配置重组反应体系前可将线性化载体与插入片段进行适当稀释，个组分加样量不能低于1ul；

(4)重组产物鉴定

PCR鉴定或测序鉴定；

第三步：DH10Bac感受态细胞转化

(1)取感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中，置于冰浴中，以下实验以100ul感受态细胞为例；

(2)向感受态细胞悬液中加入1-10ng的pFastBacHTA-CHEK1重组质粒，轻轻旋转离心管以混匀内容物，在冰浴中静置30分钟；

(3)将离心管置于42℃水浴中放置30秒，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2分钟，该过程不要摇动离心管；

(4)向每个离心管中加入900ul无菌的SOC，混匀后置于37℃，200rpm，摇床振荡培养4小时；

(5)用SOC培养基进行10倍梯度稀释，如分成3个稀释梯度10^-1，10^-2，10^-3；

(6)取100ul的各个梯度的培养物用于涂布；等平板中的液体完全吸收后，倒置平板，37℃培养24-48小时；

(7)保留剩余的菌液于4℃冰箱中，视平板上菌落生长情况决定去留；

(8)选择4个隔离良好的大的(1mm)白色菌落，再次涂板划线，至少生长16小时；

(9)过夜培养；

(10)选取重组成功的菌落PCR验证重组；

(11)验证引物为：M13-F：CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG

M13-R：AGCGGATAACAATTTCACACAGG

PCR鉴定出的片段长度为2.3kb+插入片段长度，若能鉴定出则代表转化成功，病毒体已和质粒成功连接；

4.Bacmids的提取

使用阳性克隆的midiprep，用无菌水洗脱；将纯bacmid进行分装，冷冻至-80℃；其能快速、高效产生的重组AcMNPV病毒；取杆状病毒(baculovirus)和质粒(plasmid)的英文字头字尾命名为Bacmid，即杆状病毒质粒之意；该载体可像质粒一样在大肠杆菌中生长，又对鳞翅目昆虫细胞具有感染性；

5.bacmids转染Sf9细胞

(1)使用CELLFECTIN试剂盒，将bacmids转染Sf9细胞；

(2)转染后的病毒滴度应在2-4×10⁷pfu/ml左右；再进行两次转染，病毒的滴度将超过10⁹pfu/ml；使用转染病毒三次过后的细胞检测蛋白的表达，2.5-3×10⁶个细胞，25ml培养液，15cm皿；

6.蛋白的提取

(1)将125毫升sf9细胞培养基加入在锥形玻璃瓶中,添加50～100μl的病毒滴度10⁹pfu/ml的sf9细胞，在sf9培养箱中培养三天；

(2)加入裂解液充分裂解；

7.纯化蛋白

(1)将Ni-NTA slurry放入树脂中并进行清洗；

(2)将lysate-Ni-NTA混合物分步装入5ml的塑料柱中，直到所有混合物装入；此时，如果蛋白质被EGFP标记，由于EGFP标记的蛋白质与树脂结合，蓝色树脂会变成浅绿色；

(3)用2x8ml缓冲液清洗树脂，如果egfp标记蛋白的树脂结合良好，则洗涤后的树脂保持浅绿色；

(4)添加0.75ml洗脱缓冲液到树脂中洗脱蛋白质，标记为E1，此时，如果洗脱良好，树脂的颜色会变回蓝色；

(5)继续加入4×0.75ml洗脱缓冲液，收集E2、E3、E4、E5；E1-E5各20μl用Biorad方法检测蛋白；如果蛋白质含量良好，检测结果将很快变为蓝色；

(6)E1-E5合并一起通过凝胶排阻旋转过滤器,总量约为3.75毫升,自旋为20分钟,直到大约200μl体积减少；此时，浓缩的洗脱液为绿色，表明蛋白逐步成呈颗粒状；每次用吸管混合，避免蛋白质沉淀；然后加入2ml缓冲液，开始下一轮的操作，再次降至200ul，再重复两轮；最后，原始缓冲液的总稀释量约为18×10×10×10＝1.8×10⁴；然后以将交换的洗脱液告诉旋转10分钟，小心地将上清转移到另一管中，不要搅动变性的蛋白颗粒；测量蛋白质浓缩的OD600值,在液氮中快速冻结并存储在-80℃。