[发明专利]一种检测大鲵分布的环境DNA方法

说明书

本发明属于分子技术领域，具体涉及一种检测大鲵分布的环境DNA方法。具体技术方案为：一种检测大鲵分布的环境DNA方法，使用至少一对引物对待测样品进行PCR扩增检测，电泳结果中出现158～224bp的阳性条带，则认为待测样品来源的环境中分布有大鲵，所述引物对为Ad_Cytb_E1，序列为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2。本发明利用残留水体中的中国大鲵粪便、皮肤脱落物及尸体等环境DNA，结合分子生物学技术，开发出具有高特异性、高灵敏度和通用性强的引物，建立了一种可针对大鲵属不同物种的分布进行快速、标准化检测的方法。

技术领域

本发明属于分子技术领域，具体涉及一种检测大鲵分布的环境DNA方法。

背景技术

中国大鲵(Andrias davidianus complex)是全球两栖动物保护的旗舰物种，由于过度利用、栖息地质量下降和面积减少、环境污染等原因，其野生种群急剧减少,被中国生物多样性红色名录和世界自然保护联盟红色名录列为极危物种。栖息地保护和人工种群增殖放流是该物种的重要保护措施，而检测原始或放流个体及其种群的分布是制定和评估保护措施的基础。

但由于该物种栖于水下、活动隐秘、自然种群数量极少，传统的调查方法难以凑效、耗时耗力且成本很高，亟待开发新的技术手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以快速、标准化检测大鲵分布的环境DNA方法。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一组引物对，序列为SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2。

相应的，所述引物对在检测大鲵中的应用。

相应的，利用所述引物对制备的试剂盒、试纸、检测卡纸。

相应的，一种检测大鲵分布的方法，使用至少一对引物对对待测样品进行PCR扩增检测，电泳结果中出现158～224bp的条带，则认为待测样品来源的环境中分布有大鲵，所述引物对为Ad_Cytb_E1，序列为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2。

优选的，引物对包括Ad_Cytb_E3或Ad_Cytb_E5中的任意一对或两对，Ad_Cytb_E3的序列为：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6，Ad_Cytb_E5的序列为：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10。

优选的，进行2个样品重复的PCR扩增检测，若两次重复结果不一致，则再检测一次，如果两次检测为阳性，则判定待测样品来源的环境中分布有大鲵。

优选的，PCR扩增后，对扩增产物进行测序，将测序结果在NCBI网站用Nucleotideblast程序比对，序列第一相似结果为中国大鲵(Andrias davidianus)则判定待测样品来源的环境中分布有大鲵。

优选的，PCR扩增体系为25μL，包括10μL Mix，12.5μL ddH₂O，正反向引物各0.5μL，模板2μL，模板为提取的待测样品的DNA。

优选的，PCR扩增反应条件为：预变性95℃4min，变性95℃40s，退火51.2℃60s，延伸72℃30s，再延伸72℃8min，累计35个循环。

本发明具有以下有益效果：本发明利用残留水体中的中国大鲵粪便、皮肤脱落物及尸体等环境DNA，结合分子生物学技术，开发出具有特异性和扩增效率高的引物，建立了一种可针对大鲵属不同物种的分布进行快速、标准化检测的方法。

附图说明

图1为Ad_Cytb_E1引物扩增中国大鲵组织样的扩增产物电泳图；

图2为Ad_Cytb_E3引物扩增中国大鲵组织样的扩增产物电泳图；

图3为Ad_Cytb_E5引物扩增中国大鲵组织样的扩增产物电泳图；