[发明专利]原核Argonaute蛋白的基因编辑应用

说明书

本发明公开了一种原核Argonaute蛋白的基因编辑应用，通过构建源于细菌的Argonaute蛋白的原核表达载体，以及在转化宿主细胞后对该Argonaute蛋白的表达载体和共转化载体的降解的检测以及基因组位点的检测，发现了其具有被特异性转录本激活并靶向特定DNA靶序列的能力，并且在真核细胞中转录的导向RNA的参与下，实现了对基因组靶序列进行inDel频率为3％的基因编辑。实验结果表明原核Argonaute蛋白可以用于细胞内基因编辑工具的开发。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及原核Argonaute(pAgo)蛋白的核酸酶特性以及通过其实现细胞内基因编辑工具的开发。

背景技术

基因编辑技术通常使用的基因编辑工具包括ZFNs(Kim,Skowron,zybalski 1996；Bitinaite et al.1998)和TALENs(Cermak et al.2011)，以及CRISPR/Cas9(Bikard etal.2012)。CRISPR/Cas9技术通过使用人工核酸酶对基因组DNA的目标位置引入双链断裂(Double strand breaks,DSBs)，利用细胞自身的修复途径，例如非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)，以及同源序列介导的同源重组(homologousrecombination,HR)来实现对目的基因序列的修改，能够比较精确的对生物体基因组特定目标基因位点进行修饰。但是CRISPR/Cas9技术也有一定缺陷，那就是对PAM序列的依赖(Garneau et al.2010)以及具有一定脱靶性(Zhang et al.2015)。对PAM序列的依赖使其在靶基因序列的选择上受到限制，脱靶性也造成了其在基因疾病治疗等领域应用时的潜在威胁。因此，开发出其他种类的基因编辑工具成为基因工程领域研究的重点。

原核Argonaute蛋白是细胞防御外源DNA入侵或者病毒感染的工具之一，具有降解外源DNA的能力，这一能力的发现始于荷兰瓦赫宁根大学的John van der Oost团队领衔发表的关于TtAgo作为一种以5'磷酸化的单链DNA(ssDNA)为导向序列的靶向切割互补的单链DNA序列的核酸酶(Swarts et al.2014)的研究报道。由于大多数原核Argonaute蛋白(pAgos)宿主菌的生存条件都较为极端，例如高热以及高盐，这就使得在宿主菌中研究其蛋白活性及其生理功能较为困难。

随着越来越多的关于古细菌、细菌的Argonaute蛋白与导向序列和靶序列在细胞外环境下共同孵育的实验的进行，证明了原核Argonaute蛋白的核酸切割活性。其中大多数原核Argonaute蛋白以DNA为酶作用底物(TtAgo(Swarts et al.2014)、PfAgo(Swarts etal.2015)、MpAgo(Doxzen and Doudna 2017；Kaya et al.2016)、MjAgo(Zander etal.2017)、CbAgo(Hegge et al.2019；Kuzmenko et al.2020)、RsAgo(Miyoshi etal.2016))，个别原核Argonaute蛋白也可以以RNA为酶作用底物(NgAgo(Qi et al.2016；Wuet al.2017)、RsAgo(Olovnikov et al.2013))；不同原核Argonaute蛋白的导向序列也不完全相同，有些需要导向序列的DNA 5'磷酸化修饰(TtAgo(Swarts et al.2014)、PfAgo(Swarts et al.2015)、MjAgo(Zander et al.2017)、CbAgo(Hegge et al.2019)、NgAgo(Qiet al.2016))，有些需要识别5'羟基化的DNA导向序列(MpAgo(Kaya et al.2016))。